一、CRISPR/Cas9 基因敲除原理
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。
目前，來自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA 兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
由于PAM序列結構簡單（5’-NGG-3’），幾乎可以在所有的基因中找 到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作。
目前常用的CAS9研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：
Cas9質粒構建
目前常見的CAS9普通質粒有：
雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見addgene（ lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩(wěn)定的表達，但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大于4kb），且長期插入可能導致亂切，拖把等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。同時相對于普通質粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果[3,4]。接下來，我們主要介紹一下CAS9腺病毒包裝流程。
二、實驗流程
制備帶有gRNA的caripr/cas9腺病毒穿梭質粒，分別高純度無內毒素抽提腺病毒穿梭質粒和骨架質粒，共轉染293FT細胞，轉染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)十幾天，在中間四五天左右更換一次新鮮培養(yǎng)基，然后收集細胞和1ml培液置于15ml離心管后，液氮/37度凍融三次（凍-融要徹底），2000rpm離心5分鐘，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復擴增收集病毒后，行病毒的大量擴增，然后通過CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒。
三、實驗材料
該病毒包裝系統(tǒng)為兩質粒系統(tǒng)，組成為穿梭質粒（包括 ）和骨架質粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭質粒 和 能表達綠色熒光蛋白（GFP）。和 能表達紅色熒光蛋白（RFP）。
1、載體信息（見附錄）
2、細胞株 293FT，腺病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，經培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞,生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。
3、菌株 大腸桿菌菌株DH5α。用于擴增腺病毒載體和腺病毒骨架載體質粒。
四、包裝細胞293FT細胞的培養(yǎng)（參考293T細胞培養(yǎng)，見漢恒生物-腺病毒包裝手冊）
五、腺病毒包裝、擴增和純化
（一）質粒構建
1、gRNA設計
1、利用在線CRISPR設計工具(http://tools.genome-engineering.org)設計靶向目的基因組的20 bp 長度guide sequences（引導序列）；或者，選擇一個5-NGG上游的20 bp序列作為guide sequences（引導序列）。
2、合成在線CRISPR設計工具給出的相應的的寡核苷酸序列及引物。根據酶切位點設計相應的寡核苷酸序列及引物的如下：
A：若轉染U6-sgRNA PCR 擴增產物：U6-Forword 引物不變，U6-Reverse 引物的5端則附加20-nt guide sequences 及sgRNA scaffold 序列（引物總長>100 bp）。如圖：
B：若轉染sgRNA表達質粒，則分別合成帶有酶切位點剪切殘基的guide sequences，退火后連入經BbsI 酶切的pSpCas9（BB）-GFP/puro載體骨架中。如圖：
注意：20 nt的guide sequences 的末端可加一個C堿基（G-C堿基對）以促進U6啟動子轉錄sgRNA的效率,oligo DNA 設計序列的第一個堿基必須是 G，如果你選取的 Guide 序列的第一個堿基不是 G，可自行加一個 G 上 去。
2、sgRNA和Cas9共表達質粒的構建
（1）準備sgRNA寡核苷酸插入片段：分別重懸每條sgRNA鏈（步驟2B）至終濃度100uM。
（2）用連接酶進行磷酸化及退火
（3）將sgRNA 寡聚物克隆至pSpCas9（BB）載體中。
孵育連接反應總時間1 hr，孵育條件為：37度5min，21度5min。循環(huán)1-6次。
（4）核酸外切酶除去殘留的線性化DNA
（5）轉化。推薦Stbl3 感受態(tài)。
（6）挑選2-3個單克隆，搖菌，抽質粒，測序鑒定。
3、sgRNA有效性鑒定
將sgRNA和CAS9共表達質粒轉染目的細胞，兩天后提基因組或者RNA，PCR，測序驗證sgRNA是否有效，如測序結果的峰圖有雜峰出現，或者測序結果比對時發(fā)現和原始序列比對時有缺失一段的序列，則可初步說明我們的gRNA是有效的，可以進行下一步病毒包裝。
（二）病毒包裝、擴增和純化（詳細步驟見漢恒生物-腺病毒包裝手冊）
（三）病毒感染細胞（詳細步驟見漢恒生物-腺病毒包裝手冊）
（四）感染后觀察
1、sgRNA敲除效果鑒定----連續(xù)稀釋法分選單克隆細胞系
（1）將cas9/sgRNA腺病毒加入目的細胞培養(yǎng)基進行病毒感染。
（2）感染6h后進行換液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h用于后續(xù)單細胞分離鑒定。
（3）用細胞過濾器將細胞分離成單個細胞，計算每個24孔板中的細胞數目，連續(xù)稀釋至0.5 cell/100ul，加入至96 孔板中。
（4）鋪板大約一周后觀察細胞克隆的外觀，做好標記。繼續(xù)孵育，擴增2-3周
（5）細胞長至60%以上融合度時，進行傳代。移液槍上下吹動細胞20次，每個相應的克隆傳一個孔，加20%的體積培養(yǎng)基。每2天更換培養(yǎng)液并視情況進行細胞傳代。
（6）剩余80%體積的細胞，抽提基因組，鑒定目的基因序列，送測序進行基因型分析。
2、SURVEYOR 核酸酶實驗檢測插入缺失突變。此檢測方法詳見SURVEYOR應用文件。
（1）感染目的細胞、將cas9/sgRNA腺病毒加入目的細胞培養(yǎng)基進行病毒感染。
（2）感染后換液。感染6h后進行換液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h用于后續(xù)DNA提取和基因型分析。
（3）基因組抽提。對感染病毒后的細胞進行基因組抽提，基因組抽提步驟見具體試劑盒說明書。
（4）調取目的基因。對目的基因進行引物設計，用于PCR調取目的基因序列。
（5）PCR-SSCP分析。取5μL PCR 擴增產物，與10μL上樣緩沖液( 98% 甲酰胺 0. 025% 二甲苯氰 2% 甘油0.01 mmol L－1EDTA) 混合，瞬時離心后放于PCR 儀中99℃變性 10 min， 并立即置于冰上， 冰浴30 min 后上樣于 15% 非變性聚丙烯酰胺凝膠,4℃,180 V,200 mA條件下電泳12～15 h電泳結束后取膠進行銀染顯帶,判定基因型根據電泳圖譜鑒定基因型,并按基因型選取 3～5個個體的 PCR 產物,經純化回收后送測序。
(6) 數據分析。利用 Mutation Surveyor軟件對基因進行突變分析。
3、利用RFLP分析 HDR-介導的靶向修飾的基因型。此檢測參照RFLP原理
（1）感染目的細胞、將cas9/sgRNA腺病毒加入目的細胞培養(yǎng)基進行病毒感染。
（2）感染后換液。感染6h后進行換液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h用于后續(xù)DNA提取和基因型分析。
（3）基因組抽提。對感染病毒后的細胞進行基因組抽提，基因組抽提步驟見具體試劑盒說明書。
（4）調取目的基因。對目的基因進行引物設計，用于PCR調取目的基因序列。
(5) 獲取RFLP酶切片段。對獲取的PCR產物電泳后純化膠回收。用不同的限制性內切酶對PCR產物進行隨機引物PCR，然后電泳分析獲得不同酶切特征的片段。
（6）測序分析。對獲取的不同酶切特征的片段進行膠回收后測序分析特定的突變類型。
六、動物實驗[5]（見漢恒生物病毒動物實驗資料）
七、參考文獻
[1] Patrick D. Hsu,1,2,3 Eric S. Lander,1 and Feng Zhang1,2. Cell 157, June 5, 2014. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.
[2] Krzysztof Chylinski1,2, Kira S. Makarova3, Emmanuelle Charpentier1,4,5 and Eugene V. Koonin. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42, No. 10.Classi?cation and evolution of type II CRISPR-Cas systems
[3] 方銳 暢 飛 孫照霖 李寧 孟慶勇. Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702. CRISPR/Cas9 介導的基因組定點編輯技術
[4] Melissa M. Harrison, Brian V. Jenkins, Kate M. O'Connor-Giles, et al. Genes Dev.2014 28: 1859-1872. A CRISPR view of development.
[5] gnazio Maggio*, Maarten Holkers*, Jin Liu, Josephine M.Janssen, Xiaoyu Chen & Manuel A. F. V. Gon?alves. SCIENTIFIC REPORTS | 4 : 5105 | DOI: 10.1038/srep05105. Adenoviral vector delivery of RNA-guided CRISPR/Cas9 nucleasecomplexes induces targeted mutagenesisin a diverse array of human cells
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