腫瘤研究中，該怎么樣進行circRNA研究，到底又能發(fā)表多大影響因子的文章，是大家都非常感興趣的問題。通過這篇發(fā)表在《hepatology》上的肝癌circRNA研究，我們來窺探下，從樣本準備到機制研究，到底該做些什么？
一．腫瘤特異性的circRNA篩選
a.腫瘤研究，用什么樣本去篩選呢？
癌和癌旁樣本是本研究的選擇，因為可以直接反應(yīng)病灶細胞中的的異常分子（癌和正常組織也可以考慮）。
b.多少的生物學重復比較合適？
本研究用了7個癌和7個配對癌旁的樣本進行circRNA芯片篩選（circRNA芯片，咨詢shbio.com）。理論上來說，重復越多越好，本研究7個，是性價比比較高的選擇。
c.選擇多少差異進行qRT-PCR驗證？
一般情況下，高通量篩選后，差異circRNA數(shù)量從幾十，到幾百，幾千都有可能，本研究對上調(diào)和下調(diào)最顯著的分別10個circRNA進行了驗證。
d.驗證樣本選擇多少比較合適？
芯片用了7對樣本，驗證肯定需要擴大樣本，本研究共通過21對樣本進行了確認，最后只有6個circRNA能和芯片吻合（6/20的吻合率，應(yīng)該來說在circRNA領(lǐng)域是一個比較平均的吻合率）。當然，在有樣本的情況下，只有21對還是不夠的。本研究還對261對樣本進行了驗證，結(jié)果其中的一個circRNA在87.4%的樣本中得到驗證。
二．候選深入研究的circRNA
怎么找到候選研究circRNA？
上面的驗證結(jié)果有6個符合芯片結(jié)果，那么，怎么進一步縮小范圍？本研究把其中的4個在HCC組織中下調(diào)的circRNA，都在細胞系中進行了沉默，看哪個能有表型。結(jié)果顯示，只有circMTO1能促進HCC細胞增殖。因此，circMTO1是后續(xù)研究的對象了（異位表達，有表型才是王道）。
三．circRNA與臨床指標關(guān)聯(lián)
circRNA的異常表達和臨床表現(xiàn)有什么關(guān)聯(lián)？
這個是腫瘤研究不可回避的問題，找到關(guān)聯(lián)，才能有臨床意義。因此，該研究對116對HCC的生存數(shù)據(jù)與circMTO1的表達用ISH組織芯片進行了分析。結(jié)果顯示，低的circMTO1表達與不良預后有關(guān)。因此，circMTO1可能是一個作為HCC預后診斷的指標。
四．circRNA機制研究
circRNA作用機制多樣，其中，ceRNA機制是大家很容易想到的機制，那么，circMTO1是否通過ceRNA機制發(fā)揮功能呢？
a. circRNA結(jié)合的miRNA怎么找？
首先，可以通過分析預測可能結(jié)合的miRNA
該研究通過MiRanda預測，發(fā)現(xiàn)有99個miRNA都可以結(jié)合circMTO1。
其次，通過調(diào)研目前在HCC中發(fā)現(xiàn)的miRNA，發(fā)現(xiàn)只有20個是和HCC相關(guān)（這一步很重要）。
最后，通過實驗的手段確認目標。通過RIP實驗，研究人員在20個miRNA中，確認miR-9是能和circMTO1結(jié)合的。值得注意的是，在HCC中，miR-9通常是高表達，也和病人不良預后相關(guān)。這樣，就找到了circMTO1潛在的ceRNA機制靶分子miR-9。
b. ceRNA機制研究要什么做？
來證明ceRNA調(diào)控機制，有很多工作要做。
第一步，circMTO1和miR-9是否共定位？
兩者相互作用，必定會共定位，且會在細胞質(zhì)中?；谶@個思路，該研究進行了細胞定位分析。確實，circMTO和miR-9共定位于胞質(zhì)，且在腫瘤組織中相比癌旁少。
第二步，circMTO1是否與miR-9相關(guān)調(diào)控腫瘤過程？
要解釋這個問題，先要在細胞中干預表達circMTO1。當然，要做干預表達（過表達，沉默）也有講究，用什么細胞做？
該研究先檢測了8個不同HCC細胞系，找到最高表達circMTO1,低表達miR-9細胞系HepG2 和SMMC-7721，最低表達circMTO1，高表達miR09細胞系SK-Hep1 和 QGY-7701。接下來就好做了，細胞中低表達的進行過表達cirMTO1，高表達的進行siRNA沉默。然后去觀察細胞表型變化。
結(jié)果顯示，circMTO1沉默導致細胞增殖增強，細胞侵襲變強，較少細胞凋亡；過表達得到相反的結(jié)果。同時，在沉默細胞中過表達miR-9加強促瘤表型。因此，這就把circMTO1和miR-9的功能也聯(lián)系起來了。
第三步，circMTO1吸附miR-9，影響了下游哪個基因？
ceRNA機制的核心是circRNA-miRNA-mRNA，找到了前兩個，第三個怎么找呢？
因為前面找到miR-9已經(jīng)在HCC中有研究了，那么靶基因自然而然就出來了。已經(jīng)研究表明，腫瘤抑制基因p21是miR-9靶基因（現(xiàn)在終于明白為什么當初找miRNA時需要動動腦筋了）。
第四步，circMTO1-miR-9-p21，怎么走？
HCC細胞中沉默circMTO1或者轉(zhuǎn)染miR-9 mimic，檢測p21的mRNA和蛋白表達。非常理想，p21 mRNA水平和蛋白表達都降低了。而過表達circMTO1時，p21 mRNA水平和蛋白表達都升高了。這樣就基本可以確定，circMTO1通過下調(diào)miR-9而保護了p21被降解的命運。
當然，到了這一步，還可以通過其他的途徑來進行佐證。研究人員在circMTO1沉默后，用miR-9 inhibitor降低miR-9表達。結(jié)果非常明顯，p21的mRNA水平和蛋白表達并沒有顯著降低，細胞增殖和凋亡表型也變?nèi)酢＿@樣，circMTO1-miR-9-p21這條路完全走通了。
五．體外結(jié)果，體內(nèi)驗證
其實，上面的實驗結(jié)果，基本已經(jīng)把circMTO1的生物學功能說清楚了。當然，唯一的遺憾在于，這些結(jié)果都是用體外細胞實驗做的。所以，接下來就是用裸鼠模型，通過體內(nèi)實驗在驗證circMTO1在HCC中的作用。
通過在裸鼠中移植HCC組織，持續(xù)注射circMTO1 siRNA兩周，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長迅速，血清中AFP表達增加，p21表達減少，CDK2表達受抑制，細胞侵襲，增殖markers表達上調(diào)。因此，circMTO1確實是在HCC中抑制腫瘤發(fā)展過程。
是不是有一種非常熟悉的味道？從高通量篩選，到大樣本驗證，到后面的ceRNA機制研究，最后體內(nèi)實驗驗證。該研究用一種非常熟悉的手段，驗證了一個circRNA在HCC中的重要角色。雖然沒有什么原創(chuàng)性的實驗，但也不乏各種技巧在里面，你是否已經(jīng)get到了？circRNA研究，確實難，也確實可以這么簡單。
聯(lián)系客服
