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        8月31日，著名循環(huán)學(xué)雜志Circulation在線發(fā)表了復(fù)旦大學(xué)眼耳鼻喉科醫(yī)院顏標(biāo)教授與趙晨教授為共同通訊作者的文章，介紹發(fā)現(xiàn)circular HIPK3在糖尿病視網(wǎng)膜血管障礙中的作用[1]。

        circHIPK3大家一定非常眼熟，目前已有多篇研究論文介紹發(fā)現(xiàn)了該circRNA的重要功能，包括前不久發(fā)表在EMBO Reports雜志的文章，還有復(fù)旦大學(xué)腫瘤研究所黃勝林教授2016年發(fā)表在Nature Communication雜志的文章等等。經(jīng)過(guò)整理，目前可以檢索到的關(guān)于circHIPK3的文章及主要信息概括如下：

表1 關(guān)于circHIPK3的研究論文匯總

        有個(gè)非常重要的問(wèn)題，HIPK3基因可能會(huì)形成很多種的circRNA分子，這些文章中所描述的circHIPK3是同一個(gè)分子嗎？本文中作者也提到了circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中人類HIPK3基因來(lái)源的circRNA有20種，小鼠有3種。山人從CIRCpedia數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，來(lái)自人類HIPK3的記錄達(dá)99條對(duì)應(yīng)于14種circRNA分子，小鼠也有35條記錄對(duì)應(yīng)于8種circRNA分子。那么這些文章里探討的circRNA分子是否是同一個(gè)分子呢？山人將它們的circRNA分子信息匯總至上表的概要信息中。來(lái)自HIPK3第二外顯子單獨(dú)環(huán)化的circRNA（hsa_circ_0000284）是目前主要討論的，文獻(xiàn)中提到的circHIPK3均為該分子，它的豐度很高，且與小鼠中對(duì)應(yīng)的circRNA序列同源性較高，這也是該分子受到廣泛關(guān)注的關(guān)鍵。

        本文中探討的circHIPK3也是hsa_circ_0000284，對(duì)應(yīng)于小鼠中的mmu_circ_0001052，兩者同源性較高。本文發(fā)現(xiàn)circHIPK3可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p，這些miRNA分子沒(méi)有出現(xiàn)在之前的報(bào)道中，屬于新發(fā)現(xiàn)的circHIPK3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA分子。主要的研究思路包括以下幾部分：

（1）circHIPK3的穩(wěn)定性特征與轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析；

（2）功能缺失/獲得模型研究；

（3）預(yù)測(cè)可結(jié)合的miRNA分子，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步分析相關(guān)miRNA分子下游基因網(wǎng)絡(luò)，找出可能與本文故事有關(guān)的通路和分子；

（4）體外/體內(nèi)驗(yàn)證所得到的通路模型，臨床標(biāo)本檢測(cè)。

        總體而言，本文的邏輯思路和機(jī)制研究難度不是特別大，最主要的意義是揭示了circHIPK3分子在糖尿病視網(wǎng)膜血管障礙中的作用機(jī)制，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)circHIPK3分子可以影響血管生成作用，對(duì)于疾病治療和診斷有重要價(jià)值。

1. circHIPK3的穩(wěn)定性特征與轉(zhuǎn)錄機(jī)制分析

        經(jīng)過(guò)保守性分析及表達(dá)量分析后，作者選擇人中的hsa_circ_0000284和小鼠中的mmu_circ_0001052分別作為circHIPK3分子進(jìn)行下一步研究。首先從小鼠的各種臟器組織和人的多種內(nèi)皮細(xì)胞系中分析circHIPK3的表達(dá)情況。然后也做了Sanger測(cè)序驗(yàn)證了junction point上下游的序列。

圖1 circHIPK3序列鑒定與表達(dá)特征分析 （來(lái)自[1]）

        作者還在HRVECs細(xì)胞中分析了circHIPK3穩(wěn)定性的問(wèn)題，主要是通過(guò)真核轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄，然后分析隨著時(shí)間推移，相關(guān)RNA豐度的變化情況。結(jié)果表明circHIPK3的半衰期大于34小時(shí)，而線性HIPK3分子半衰期還不到5小時(shí)。

圖2 circHIPK3穩(wěn)定性分析（來(lái)自[1]）

        進(jìn)一步的研究表明circHIPK3分子主要存在于胞質(zhì)中（作為micro RNA Sponge功能模型的重要特征）。作者還初步分析了circHIPK3表達(dá)量與糖尿病模型的關(guān)系，小鼠糖尿病模型中表明高唐處理后，circHIPK3的表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而迅速增加。此外，一些糖尿病伴隨癥狀也與circHIPK3表達(dá)升高有關(guān)，如氧化應(yīng)激，炎性作用等等。

圖3 circHIPK3在糖尿病模型中高糖刺激后表達(dá)顯著升高（來(lái)自[1]）

        作者借助TRANSFAC工具分析了可能影響circHIPK3轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)糖尿病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Myb有可能介導(dǎo)circHIPK3的轉(zhuǎn)錄。于是進(jìn)一步通過(guò)干擾c-Myb，ChIP-PCR及構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了c-Myb與circHIPK3的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。

圖4 c-Myb介導(dǎo)circHIPK3的轉(zhuǎn)錄（來(lái)自[1]）

2. circHIPK3敲低或過(guò)表達(dá)的效應(yīng)

        為探索circHIPK3與糖尿病視網(wǎng)膜血管障礙的關(guān)系，作者分別進(jìn)行circHIPK3的敲低或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分析circHIPK3在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的效應(yīng)。MTT實(shí)驗(yàn)表明干擾circHIPK3后細(xì)胞增殖減慢，EdU摻入實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明干擾circHIPK3后細(xì)胞遷移率下降，管形成（tube formation）能力也下降。過(guò)表達(dá)circHIPK3后細(xì)胞增殖和遷移等指標(biāo)均增強(qiáng)。

圖5 敲低/過(guò)表達(dá)circHIPK3的細(xì)胞效應(yīng)分析 （來(lái)自[1]）

3. miRNA互作網(wǎng)絡(luò)分析 

        miRNA Sponge是目前報(bào)道最多的circRNA功能模型，作者也分別通過(guò)Ago蛋白R(shí)IP實(shí)驗(yàn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，還有FISH實(shí)驗(yàn)進(jìn)行共定位分析。最終得出結(jié)論：circHIPK3可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p發(fā)揮miRNA Sponge作用，其中對(duì)miR-30a-3p的作用最強(qiáng)。接著，利用TargetScan工具預(yù)測(cè)分析了miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p的作用下游分子。發(fā)現(xiàn)VEGFC、FZD4和WNT2三個(gè)候選靶標(biāo)分子。進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建這些基因3’UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因，證明了它們的相互作用通路。至此，形成了一個(gè)circHIPK3-miR-30a-3p-VEGFC/WNT2/FZD4軸的信號(hào)通路。

圖6 circHIPK3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-30a-3p （來(lái)自[1]）

4. circHIPK3相關(guān)通路的體體外體內(nèi)分析

        HRVEC細(xì)胞中表達(dá)miR-30a-3p的模擬物分子能顯著影響circHIPK3導(dǎo)致的細(xì)胞增殖，遷移和管形成相關(guān)的表型，與直接干擾circHIPK3的表型一致。添加VEGFC或過(guò)表達(dá)WNT2/FZD4均能部分恢復(fù)直接干擾circHIPK3的表型。

圖7 circHIPK3相關(guān)通路的體外實(shí)驗(yàn)（來(lái)自[1]）

        通過(guò)體內(nèi)注射circHIPK3的感干擾RNA，作者證明circHIPK3參與了糖尿病相關(guān)視網(wǎng)膜血管功能障礙的過(guò)程。

圖8 體內(nèi)干擾circHIPK3實(shí)驗(yàn)（來(lái)自[1]）

        對(duì)于所得到的完整通路的體內(nèi)分析，作者主要分析了miR-30a-3p的拮抗劑對(duì)糖尿病表型的影響。注射miR-30a-3p的拮抗劑后VEGFC、 FZD4和WNT2的表達(dá)升高。生物素標(biāo)記的miR-30a-3p進(jìn)行RNA Pull-down實(shí)驗(yàn)也表明miR-30a-3p可以結(jié)合到circHIPK3和VEGFC、 FZD4和WNT2的mRNA分子。干擾circHIPK3后可明顯釋放所競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的miR-30a-3p分子，注射miR-30a-3p拮抗劑RNA則可抑制干擾circHIPK3所帶來(lái)的變化。

圖9 circHIPK3相關(guān)通路的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（來(lái)自[1]）

        在臨床標(biāo)本中，作者分析了circHIPK3表達(dá)量與糖尿病相關(guān)癥狀的關(guān)系。與非糖尿病的特發(fā)性視網(wǎng)膜病變對(duì)照相比，糖尿病引起視網(wǎng)膜血管功能障礙組的纖維血管膜中circHIPK3顯著升高。糖尿病患者胞質(zhì)中circHIPK3表達(dá)量顯著升高。表明糖尿病的視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞circHIPK3的表達(dá)顯著升高。

圖11 臨床標(biāo)本檢測(cè)circHIPK3 （來(lái)自[1]）

        本文系統(tǒng)分析了circHIPK3在糖尿病視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用，發(fā)現(xiàn)了circHIPK3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-30a-3p進(jìn)而影響下游基因VEGFC/WNT2/FZD4，豐富了對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜血管功能障礙疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也提出了有價(jià)值的疾病診斷和治療備選方案。

參考文獻(xiàn)：

1. Shan, K., et al., Circular Non-Coding RNA HIPK3 Mediates Retinal Vascular Dysfunction in Diabetes Mellitus. Circulation, 2017.

2. Zheng, Q., et al., Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun, 2016. 7: p. 11215.

3. Li, Y., et al., CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO Rep, 2017.

4. Liang, D. and J.E. Wilusz, Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes Dev, 2014. 28(20): p. 2233-47.

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6. Jeck, W.R., et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA, 2013. 19(2): p. 141-57.

7. 朱學(xué)軍, 田.王.肖., 環(huán)狀RNA CircHIPK3通過(guò)miR-379調(diào)控IGF1表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299與NCI-H2170的細(xì)胞增殖. 中國(guó)肺癌雜志, 2017.

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