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https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1097276518303976
發(fā)育過(guò)程中，穩(wěn)定的和遺傳的基因表達(dá)形成細(xì)胞多樣性。研究表明，組蛋白翻譯后修飾對(duì)于建立和維持細(xì)胞身份起著決定作用1, 2。其中，H3K27me3是由PRC2（Polycomb repressive complex 2）催化形成，與染色體的抑制狀態(tài)相關(guān)3。PRC2通過(guò)EED亞基能夠結(jié)合自身催化產(chǎn)物H3K27me3，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化，激活PRC2。雖然大量研究聚焦于哺乳動(dòng)物中Polycomb在基因組的定位，但是PRC2如何被招募至特定基因組位點(diǎn)以及如何建立H3K27me2/3尚不清楚。在該研究中，研究工作者在mESCs中基于Cre-Loxp系統(tǒng)設(shè)計(jì)了可誘導(dǎo)的EED表達(dá)系統(tǒng)，重現(xiàn)H3K27me2/3的動(dòng)態(tài)建立過(guò)程；同時(shí)確定PRC2成核及延伸的精確基因組位點(diǎn)，并確定了其在染色體初始募集和穩(wěn)定的關(guān)鍵蛋白。
一、在mESCs中破壞EED與H3K27me3相互作用降低H3K27me3水平
EED的晶體結(jié)構(gòu)顯示其Phe97，Tyr148和Tyr365與H3K27me3能直接相互作用4。為確定這種相互作用是否是在體維持染色體的抑制狀態(tài)所必須的，該研究小組利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲入Phe97或者Tyr365 EED突變（F97A或Y365A），同時(shí)Tyr358 (Y358A)突變作為陰性對(duì)照，如圖1A，突變F97和Y365顯著降低H3K27me3水平，而另一個(gè)染色體抑制狀態(tài)的marker H3K9me3未受影響，質(zhì)譜定量分析顯示，與WT相比，突變F97和Y365后H3K27me3從30%降低為1%，而EED敲除完全消除H3K27me3（圖1B）。該研究小組通過(guò)ChIP-seq確定了剩余1% H3K27me3和SUZ12/PRC2在基因組的分布情況，如圖1C和1D，和預(yù)期的一致，F(xiàn)97和Y365突變導(dǎo)致PRC2所有靶基因的H3K27me3水平顯著降低，如HoxC基因（圖1E），然而，在有些區(qū)域，即使F97和Y365突變，仍可維持部分的H3K27me3，如HoxD基因（圖1F）。值得注意的是，SUZ12（是PRC2復(fù)合體的一部分）的ChIP-seq顯示，即使在F97和Y365突變的mESCs細(xì)胞內(nèi)，PRC2也是嚴(yán)格定位在殘余的H3K27me3位點(diǎn)（圖1C）。因此，PRC2中EED與H3K27me3的相互作用是PRC2在染色體上延伸所必須的。
二、H3K27me3的起始和延伸機(jī)制
為檢測(cè)上述PRC2結(jié)合區(qū)域能否作為Polycomb在染色體起始的成核位點(diǎn)，該研究小組基于Cre-lox的系統(tǒng)，設(shè)計(jì)可誘導(dǎo)的EED表達(dá)系統(tǒng)，式在體重新建立H3K27me2/3，并進(jìn)行追蹤，如圖1A，具體方法如下：
在具有CreERT2（可誘導(dǎo)表達(dá)Cre酶）的mESCs中敲除內(nèi)源EED的第10和11位外顯子；
在第9位外顯子后面反向插入EED第10、11和12位外顯子對(duì)應(yīng)的原始cDNA序列或者突變體Y365A的序列，其C端在T2A-GFP上游含有Flag-HA標(biāo)簽，3’端有剪切受體（splice-acceptor，SA），5’端有Poly A尾（pA），雙臂加上反向的LoxP位點(diǎn)（PS：在Cre酶作用下能在反向loxp位點(diǎn)發(fā)生DNA片段倒位）；（這里的GFP用來(lái)指示重組EED蛋白表達(dá)成功，前面有T2A元件能在轉(zhuǎn)錄后翻譯時(shí)發(fā)生自我剪切，不用擔(dān)心其影響重組蛋白活性）
當(dāng)H3K27me2/3消失后進(jìn)行細(xì)胞傳代；
4-Hydroxytamoxifen（4-OHT）處理上述細(xì)胞，Cre酶發(fā)生作用，插入cDNA序列發(fā)生倒位，挽救WT或Y365A突變的EED蛋白表達(dá)，從而重新建立H3K27me2/3。
圖1 在mESCs中破壞EED和H3K27me3相互作用降低H3K27me3水平
該研究者分別以“i-WT-r”和“i-MT-r”表示含有EDD 的WT和Y365A突變的細(xì)胞。在i-WT-r細(xì)胞中，4-OHT處理12h后， ChIP-seq顯示H3K27me3早期的富集位點(diǎn)與突變EED后保留的H3K27me3位點(diǎn)是一致的（如圖2B和2C），該研究者將此位點(diǎn)命名為成核位點(diǎn)（nucleation sites），因?yàn)樗鼈兪荘RC2首先被招募及H3K27me3形成的位點(diǎn)。有趣的是，如圖2C，這些位點(diǎn)也特異地富集于高密度的CpG區(qū)域（CpG islands，CGIs）。如圖2D~2E，在4-OHT處理12h后，成核位點(diǎn)無(wú)論強(qiáng)弱，都與PRC2和H3K27me2/3的富集相關(guān)。在i-WT-r細(xì)胞中，EED誘導(dǎo)36h后，H3K27me3從成核位點(diǎn)延伸至較遠(yuǎn)位點(diǎn)，與穩(wěn)定狀態(tài)的WT中H3K27me3分布情況相似（圖2B，以及2C的通道3和10），這些有成核位點(diǎn)延伸形成的H3K27me3被成為延伸位點(diǎn)（spreading sites），主要存在于成核位點(diǎn)上下游±10kb區(qū)域（圖2C的通道1），SUZ12證明這些區(qū)域PRC2水平都比較低（圖2F）。
圖2 PRC2從富含特定基序的高CGI密度的區(qū)域起始延伸
WT EED挽救揭示了正常狀態(tài)下H3K27me2/3動(dòng)態(tài)建立的過(guò)程，在12h時(shí)，H3K27me3出現(xiàn)在成核位點(diǎn)，同時(shí)H3K27me2也主要富集于此；在36h，H3K27me3發(fā)生延伸，但成核位點(diǎn)出現(xiàn)更多富集，相反，H3K27me2在成核位點(diǎn)減少，富集于延伸位點(diǎn)，因此，H3K27me2優(yōu)先于H3K27me3出現(xiàn)在成核位點(diǎn)，隨后轉(zhuǎn)變成為H3K27me3。重要的是，這與先前研究一致，H3K27me2主要出現(xiàn)在基因間隔區(qū)或者基因內(nèi) 5，而不是CGIs區(qū)域，約71%的H3K27me3出現(xiàn)在TSSs位點(diǎn)上下游±5kb。
突變EED挽救展示了非常不同的H3K27me2/3的動(dòng)態(tài)變化，在36h，很少的H3K27me3位點(diǎn)與i-MT-r中是一致的，相反，H3K27me2的變化反映了i-WT-r中H3K27me3的變化，在12h，H3K27me2出現(xiàn)在成核位點(diǎn)而不存在于延伸位點(diǎn)，在36h，與WT相比，H3K27me2在成核位點(diǎn)增強(qiáng)并未在延伸位點(diǎn)有效富集。綜上，EED不是成核位點(diǎn)PRC2的起始招募和H3K27me2形成所必須的，但卻是催化H3K27me2/3所必須的。
圖3 EDD和H3K27me3相互作用順式激活PRC2
為證實(shí)PRC2確實(shí)可以跨越核小體之間發(fā)揮功能，該研究工作者體外構(gòu)建特定的核小體，如圖3A，2個(gè)H3K27位點(diǎn)修飾的核小體與3個(gè)H3K27位點(diǎn)未修飾的核小體，同時(shí)分別使用WT和突變的EED的PRC2處理，檢測(cè)甲基化水平，如圖3B和3C， H3K27me3水平隨PRC2的量增加而增多，更重要的是這種增加依賴于EED。
以上證據(jù)顯示，EED與H3K27me3的相互作用是PRC2從成核位點(diǎn)發(fā)揮其H3K27me3催化活性所必須的。
三、MTF2和JARID2是PRC2靶向染色體所需的
為確定參與染色體上PRC2招募和穩(wěn)定的因子，該研究工作者通過(guò)ChIP-MS分析了富集在成核位點(diǎn)附近的蛋白，如圖4A，EED突變后富集在成核位點(diǎn)，不能有效延伸H3K27me2/3。除了預(yù)期的PRC2核心亞基外，其他蛋白也富集在成核位點(diǎn)附近（圖4B），其中，JARID2、 AEBP2和MTF2具有DNA結(jié)合特性，對(duì)于PRC2的招募和活性起著重要作用6。值得注意的是，在穩(wěn)定狀態(tài)的mESCs中，單獨(dú)消除這些因子并不能破壞PRC2的招募以及H3K27me3的水平。重要的是，MTF2和JARID2能定位在GC豐富的DNA區(qū)域7，與本研究中的成核位點(diǎn)CGIs相似?；诖耍撗芯抗ぷ髡咧攸c(diǎn)研究了MTF2和JARID2在PRC2招募中的作用，如圖4C和4D，同時(shí)敲除MTF2和JARID2后，PRC2在染色體的招募完全缺失，而在24h時(shí)，單獨(dú)敲除MTF2也有類似效果，提示相對(duì)于JARID2，MTF2在PRC2的招募中的作用更強(qiáng)，但是8天后仍能建立PRC2的起始招募。因此，MTF2和JARID2是PRC2在染色體起始招募和維持所需的蛋白因子。
圖4 敲除MTF2與JARID2破壞PRC2在染色體的定位
四、成核位點(diǎn)促進(jìn)H3K27me3的延伸并存在空間的相互作用
該研究小組推測(cè)，成核位點(diǎn)起著啟動(dòng)PRC2活性擴(kuò)散的作用，無(wú)論在基因局部還是遠(yuǎn)距離的區(qū)域，但由于空間結(jié)構(gòu)（3D）而緊密連接。如圖5A，該研究小組在i-WT-r細(xì)胞中刪除了已確定的成核位點(diǎn)，4-OHT誘導(dǎo)后，與WT相比，刪除成核位點(diǎn)后延緩延伸位點(diǎn)H3K27me3形成，但在36h后延伸位點(diǎn)的H3K27me3水平幾乎全部恢復(fù)（圖5B）。因此，成核位點(diǎn)能促進(jìn)PRC2活性的擴(kuò)散。
最近基于3C技術(shù)的方法已經(jīng)表明，由于長(zhǎng)程相互作用，Polycomb靶標(biāo)基因在mESCs中形成高度富集的H3K27me3區(qū)域的簇8。這種染色體組織方式可能精心編排了PRC2活性遠(yuǎn)距離的延伸，因此，該研究小組將確定的成核位點(diǎn)與已知的Polycomb靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，如圖5C，這些基因中H3K27me3的水平與成核位點(diǎn)（Y365A突變）中H3K27me3水平相似。為進(jìn)一步確定成核位點(diǎn)的空間接近性，該研究小組使用4C-seq確定了Evx2成核位點(diǎn)與其他成核位點(diǎn)存在較多相互作用（圖5D），與WT相比，Y365突變的成核位點(diǎn)與Evx2成核位點(diǎn)的相互作用沒(méi)有顯著變化，但是EED敲減后，兩個(gè)成核位點(diǎn)Lhx2和Pax6與Evx2成核位點(diǎn)相互作用顯著降低。因此，成核位點(diǎn)在空間上彼此接近，且部分依賴于Polycomb形成的染色體抑制域。
五、PRC2活性能從染色體上成核位點(diǎn)延伸至鄰近及遠(yuǎn)處區(qū)域形成H3K27me3
為了使H3K27me3的形成可視化，該研究小組使用免疫熒光進(jìn)行了檢測(cè)，如圖6A，EED敲除后，不能形成H3K27me3，而在EED誘導(dǎo)12h后，能檢測(cè)到少量H3K27me3形成，呈散點(diǎn)分布；在EED誘導(dǎo)24h，H3K27me3顯著增多，顯著聚集，散點(diǎn)變大。免疫熒光原位雜交確定了12h形成的H3K27me3小點(diǎn)，與Evx2成核位點(diǎn)共定位比延伸位點(diǎn)HoxC共定位高很多（圖6B）。因此，這些數(shù)據(jù)顯示H3K27me3能從這些小點(diǎn)延伸至鄰近區(qū)域。在i-WT-r細(xì)胞中敲除JARID2和MTF2后進(jìn)行了相似的分析，如圖6C，和預(yù)期的一致，在EED誘導(dǎo)12h后，H3K27me3并未檢測(cè)到，而EED誘導(dǎo)24h后，延遲的H3K27me3能夠檢測(cè)到，但是在8天后并未檢測(cè)到穩(wěn)定的PRC2招募（圖4C和4D）。因此，在缺少JARID2和MTF2時(shí)，PRC2能被瞬時(shí)招募至成核位點(diǎn)形成H3K27me3 foci但并不能穩(wěn)定存在。
圖6 H3K27me3 foci從成核位點(diǎn)至鄰近和遠(yuǎn)距離區(qū)域的延伸
為了確定成核位點(diǎn)H3K27me3 foci的遠(yuǎn)距離延伸，該研究小組在i-WT-r細(xì)胞中基于Tet阻遏蛋白（TetR）和Tet操縱子（TetO）系統(tǒng)設(shè)計(jì)了PCR2靶向招募系統(tǒng)：如圖6D，在正常情況下，TetR與TeO相互作用，阻止其他蛋白與TetO相互作用，而在doxycycline（Dox）作用下，其與TetR相互作用改變其構(gòu)象，介導(dǎo)其他蛋白與TetO的相互作用，使用TetR-EZH2就能介導(dǎo)PRC2在特定位點(diǎn)的招募。如圖6E，使用TetR-EZH2，在Dox誘導(dǎo)下，PRC2被招募在HoxC cluster下游約150kb的區(qū)域后使招募位點(diǎn)H3K27me3水平顯著增加，同時(shí)增加HoxC基因中H3K27me3水平，而陰性對(duì)照的Gene Desert（與HoxC cluster沒(méi)有相互作用）。因此，PRC2活性能從成核位點(diǎn)延伸至存在相互作用的遠(yuǎn)端區(qū)域。
以上證據(jù)顯示，PRC2活性能從成核位點(diǎn)延伸至鄰近及遠(yuǎn)處區(qū)域形成H3K27me3。
圖7 PCR2招募至染色體建立H3K27me2/3
六、PCR2招募至染色體建立H3K27me2/3的模型
基于以上研究，該研究小組提出了PCR2招募至染色體建立H3K27me2/3的模型，如圖7，在EED敲除的mESCs細(xì)胞中，并非所有的成核位點(diǎn)全部消失，一些成核位點(diǎn)仍存在空間的相互作用；一旦EED誘導(dǎo)表達(dá)，PRC2便被招募至富含特定CGIs的成核中心（nucleation hubs），PRC2單獨(dú)存在時(shí)與染色質(zhì)結(jié)合不是很緊密，當(dāng)Jarid2和MTF2形成復(fù)合體后與染色質(zhì)緊密結(jié)合；當(dāng)聚集足夠量復(fù)合體后，在成核位點(diǎn)H3K27me2首先形成，接著被轉(zhuǎn)化成H3K27me3；在形成H3K27me3 foci后，H3K27me3便在鄰近和遠(yuǎn)處區(qū)域迅速延伸。
七、思考和討論
本研究在mESCs細(xì)胞中基于Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建了可誘導(dǎo)EED表達(dá)系統(tǒng)，為我們展示PCR2介導(dǎo)H3K27me2/3的動(dòng)態(tài)建立過(guò)程，這一系統(tǒng)值得我們借鑒，在同樣細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定靶基因敲除，又可以通過(guò)4-OHT誘導(dǎo)挽救其表達(dá)，也可用于研究其他表觀修飾建立的過(guò)程，但要找準(zhǔn)關(guān)鍵蛋白，且該修飾不導(dǎo)致細(xì)胞致死；
本研究中提到在mESCs細(xì)胞中，EED突變的細(xì)胞與WT有相似的形態(tài)和基因表達(dá)譜但是不能進(jìn)行分化，提示EED與H3K27me3相互作用對(duì)于mESCs的分化過(guò)程至關(guān)重要，同時(shí)其它染色質(zhì)抑制域修飾（eg，H3K9me3）對(duì)于維持基因表達(dá)起著關(guān)鍵作用。這也提示課題研究中細(xì)胞選擇的重要性，另外就是在干性細(xì)胞中H3K27me3對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控可能不是必須的；
在課題開展過(guò)程中，巧妙應(yīng)用和改造現(xiàn)有技術(shù)能有效解決問(wèn)題，例如文中，Cre-loxp系統(tǒng)和4-OHT誘導(dǎo)系統(tǒng)、Tet On/Off中TetR-EZH2的融合，但是改造現(xiàn)有技術(shù)或體系一定是建立在對(duì)這些系統(tǒng)原理十分清楚的基礎(chǔ)上。
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