CRISPR可謂是近年來生物界的焦點(diǎn)，其針對(duì)復(fù)雜有機(jī)體基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行操作（突變、插入或缺失）的手段對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。這項(xiàng)技術(shù)相對(duì)于ZFN、TALEN等基因打靶技術(shù)可以說是簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)得多，一般的實(shí)驗(yàn)室都可以構(gòu)建自己的平臺(tái)。CRISPR/Cas9基因組編輯目前正應(yīng)用得如火如荼，但若要轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，準(zhǔn)確檢測(cè)脫靶效應(yīng)則是必不可少的。
CRISPR脫靶帶來的煩惱
早在2013年，來自麻省總醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)使用CRISPR-Cas系統(tǒng)有一個(gè)重要局限：CRISPR-Cas會(huì)在預(yù)期靶點(diǎn)以外的位點(diǎn)上生成多余的DNA突變。此后陸續(xù)有研究直接說明了CRISPR/Cas9存在嚴(yán)重的脫靶性，即該技術(shù)會(huì)發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變，這樣會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性以及研究工作的大量增加，這一問題也嚴(yán)重地限制了Cas9的應(yīng)用。
在全基因組范圍鑒定脫靶效應(yīng)的方法時(shí)有報(bào)道，但這些方法有可能錯(cuò)過低頻率的脫靶突變，而且高效轉(zhuǎn)染的要求也限制了其應(yīng)用。以往人們?cè)跈z測(cè)CRISPR-Cas誘導(dǎo)的脫靶DNA斷裂時(shí)，往往事先假定脫靶位點(diǎn)與靶位點(diǎn)相似。然而許多脫靶突變發(fā)生在與目標(biāo)位點(diǎn)差異很大的地方，因此脫靶DNA斷裂的數(shù)量和位置是很難預(yù)測(cè)的。GUIDE-seq是一種通過高通量實(shí)驗(yàn)手段在全基因組范圍鑒定脫靶效應(yīng)的方法，而且它相當(dāng)靈敏。
評(píng)估脫靶效應(yīng)的利器——GUIDE-seq
GUIDE-Seq高通量測(cè)序技術(shù)能夠很好克服以上問題，它極大提升檢測(cè)通量，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)在低轉(zhuǎn)染效率的情況下保持高靈敏度的低頻突變檢測(cè)效率，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。
其原理是，利用一種短雙鏈寡核苷酸標(biāo)簽來標(biāo)記CRISPR-Cas誘導(dǎo)的斷裂（在靶和脫靶），然后對(duì)標(biāo)簽所在的基因區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，最后利用生物信息學(xué)分析確定脫靶突變的位置以及突變頻率。研究表明，就算某個(gè)脫靶突變的出現(xiàn)頻率低至0.1%，通過GUIDE-seq也能夠檢測(cè)得到。
圖1. GUIDE-seq分析原理
圖2. GUIDE-seq分析流程
GUIDE-seq技術(shù)優(yōu)勢(shì)
現(xiàn)有脫靶評(píng)估工具主要是通過分析目標(biāo)序列來完成，但研究顯示，這些工具不但在預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)率低，還存在假陽(yáng)性率高等情況（錯(cuò)誤檢出實(shí)際不被酶切位點(diǎn)）。
相比之下，GUIDE-seq不需要高效轉(zhuǎn)染，從而避免了對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性的影響。此外，活性核酸酶的濃度可以盡可能的高，從而將低頻率突變一網(wǎng)打盡。同時(shí)，GUIDE-seq具有更高的信噪比，且需要的測(cè)序reads量少，在鑒定全基因組的脫靶位點(diǎn)時(shí)，它有望實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度。這種特性都使得GUIDE-seq在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現(xiàn)有的細(xì)胞或生化方法表現(xiàn)更佳。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過GUIDE-seq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)HEK293細(xì)胞系的三個(gè)靶點(diǎn)位置進(jìn)行篩選，最終篩選出sgRNA在靶效率更高的site 2位點(diǎn)，從而提升了CRISPR編輯的準(zhǔn)確性[1]。
注：第一行為預(yù)期靶序列（在靶位點(diǎn)），與靶序列不一致的堿基則高亮顯示；序列右側(cè)為每個(gè)（在靶/脫靶）位點(diǎn)測(cè)序得到的reads數(shù)目；在靶序列用黑色實(shí)心方塊標(biāo)識(shí)。
如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？
想利用這么方便的技術(shù)檢測(cè)自己的CRISPR在靶效應(yīng)，卻不知道如何操作？聯(lián)系我們，就會(huì)有專業(yè)的技術(shù)人員為你設(shè)計(jì)特定的短雙鏈寡核苷酸標(biāo)簽。如果遇到實(shí)驗(yàn)問題，我們還會(huì)派發(fā)相關(guān)實(shí)驗(yàn)資料并指導(dǎo)客戶進(jìn)行簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)操作。
以下為送樣參考：
樣本類型：完成CRISPR-Cas基因操作并加入dsODN的細(xì)胞樣本或DNA樣本（基迪奧提供專門技術(shù)指導(dǎo)）
DNA樣本量：總量3-5 μg，濃度30ng/μL，無明顯降解
細(xì)胞樣本量：1×106 個(gè)細(xì)胞或10 cm2 培養(yǎng)面積
參考文獻(xiàn)：
【1】Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187–97 (2015).
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