胎兒胎盤嵌合對胎兒游離DNA檢測的影響：一個常見的生物學現(xiàn)象
背景
胎兒非整倍體的無創(chuàng)產前檢測是一項重要的技術進步，臨床醫(yī)師在提供檢測前咨詢時，應當告知cfDNA的結果與超聲檢查和/或胎兒實際的染色體構成不一致的情況。由于cfDNA檢測的是胎盤來源的核酸，因此會遇到傳統(tǒng)血清學篩查不常遇到的問題。本文的目的是在cfDNA檢測的新時代，解釋胎盤遺傳學，以便在檢測前解釋其優(yōu)勢與局限性，并在篩查結果與“事實”不符的情況下對檢測后咨詢提供幫助。
cfDNA檢測的基礎與胎盤絨毛的生物學
cfDNA檢測的DNA片段來自胎盤絨毛外層凋亡的滋養(yǎng)層細胞，檢測目的是發(fā)現(xiàn)21、18和13三體。最近一項Meta分析顯示，cfDNA對于胎兒非整倍體檢出具有很高的敏感性、特異性。單胎妊娠中，各目標染色體的復合檢出率及假陽性率(FPR)分別為： T21(99.2% ， 0.09%), T18(96.3% ，0.13%), T13(91.0%，0.13%)，45,XO(90.3%，0.23%), 其他性染色體(93%，0.14%)。雙胎妊娠中T21的檢出率和FPR為93.7%、0.23%。這項Meta分析包括的37個研究具有很大的異質性，但各研究都有假陽性和假陰性的情況存在。
除了技術原因，造成檢測結果與胎兒染色體構成不一致的生物學原因或者來自母親，或者來自胎兒。胎兒因素包括胎兒部分比例不足、胎兒胎盤嵌合體及雙胎之一消失;母體因素包括母體本身染色體異常、母體惡性腫瘤。移植男性器官、組織可能造成胎兒性別檢測的錯誤。由于cfDNA檢測的是母體與胎兒胎盤的混合DNA，因此胎兒胎盤構成不一致使得cfDNA只能成為篩查而不是診斷方法。
1983年BrunoBrambati和Giuseppe Simoni教授在米蘭進行了世界上首例成功的絨毛染色體核型分析。當時認為胎盤的染色體組成忠實地反映了真正的胎兒染色體核型。而不久之后，科學家們遇到了一個新的生物學現(xiàn)象：染色體嵌合體造成的胎兒胎盤不一致。嵌合核型中的三體可能是合子形成后有絲分裂過程中發(fā)生了“不分離”錯誤，也可能是I期或II期減數(shù)分裂時發(fā)生了“不分離”，合子形成后糾正這一錯誤造成的。根據(jù)“不分離”錯誤發(fā)生的時間和機制，異常細胞系可以同時存在于胎盤和胎兒，也可以僅存在于胎兒或僅存在于胎盤。在前兩種情況中，胎兒為真正的嵌合體(TFM)，通過羊膜腔穿刺可證實;第三種情況即為限制性胎盤嵌合體(CPM)，需要通過胎盤細胞遺傳學分析證實。
絨毛染色體核型分析的金標準包括對細胞滋養(yǎng)細胞及間質核心的核型分析。通過這種分析方法，絨毛的嵌合可以分為3種：1型, 染色體異常只存在于細胞滋養(yǎng)細胞;2型，染色體異常局限于絨毛的間質核心;3型，染色體異常在兩種成分中都能看到。當絨毛核型分析提示為嵌合體的時候，必須通過對羊水細胞的核型分析區(qū)分CPM和TFM。
一項對于1001個嵌合胎盤的研究有兩個主要發(fā)現(xiàn)：首先， TFM和CPM在常見非整倍體中的發(fā)生頻率具有染色體特異性。當絨毛存在嵌合時，胎兒受累的可能性取決于多個因素，包括異常細胞系分布的類型(1、2、3型)和方式(異常嵌合或異常非嵌合)、受累的染色體及染色體異常的類型。例如，2和7-三體是最常見的絨毛嵌合染色體，但羊水細胞都正常。T13在絨毛嵌合中較少見，胎兒受累比例為2.4%，而T21絨毛嵌合時胎兒受累比例達34%。然而，當T21與小的額外標記染色體以3型在絨毛中分布時，胎兒受累的比例為100%。其次，細胞滋養(yǎng)細胞的核型并不總與胎兒相符。大約1%的產前病例中，細胞滋養(yǎng)細胞含有正常細胞系，而胎兒不正常，反之亦然。這可以造成cfDNA的假陰性和假陽性結果。假陰性的風險為：T13 1/136、T18 1/64、T21 1/135、45,XO1/14。假陽性的風險取決于細胞滋養(yǎng)細胞嵌合的水平以及檢測方法對低比例嵌合體的靈敏度。目前，將30%作為可檢測出的嵌合比例切割值時，估計FPR為：T13 1/3754、T18 1/7472、T21 1/7372、45,XO 1/1421。由于假陰性和假陽性的存在，后續(xù)的產前診斷非常重要。
羊水細胞染色體核型是診斷的金標準，但由于cfDNA檢測主要在早孕期施行(≥9-10周)，而羊水穿刺至少要在孕15周以后進行，等待過程中會有一部分孕婦因恐懼而選擇未經驗證就終止妊娠。由于常見非整倍體的胎兒胎盤差異對于不同染色體發(fā)生頻率不同，cfDNA高風險后如果實施絨毛活檢(CVS)，那么絨毛細胞嵌合的風險也存在染色體特異性，需要后續(xù)羊膜腔穿刺證實。cfDNA高風險后絨毛嵌合的風險為：T21 2%、T18 4%、T13 22%、45,XO59%。這些風險是通過前瞻性收集絨毛核型后，回顧性分析得出的。雖然隨訪不足，但這是目前僅有的數(shù)據(jù)。這項研究還發(fā)現(xiàn)，對于cfDNA T21和T18高風險的病例來說，選擇CVS作為診斷手段是合理的，因為絨毛嵌合的風險與胎兒嵌合的風險相似或略高(~2%)。如果cfDNA提示45,XO高風險，由于絨毛嵌合的比例高，因此要選擇中孕期羊膜腔穿刺。T13高風險也應選擇羊膜腔穿刺，特別是在超聲沒有異常發(fā)現(xiàn)的情況下。如果超聲檢查發(fā)現(xiàn)畸形，無論cf DNA結果如何，即便CVS存在嵌合風險，也應選擇CVS，以便盡早診斷。實際臨床工作中，如果cf DNA高風險的孕婦選擇CVS作為產前診斷手段，需要同時分析細胞滋養(yǎng)細胞和間質核心，以獲得胎兒是否受累的最準確的風險評估。
由于母親不帶有Y染色體，因此認為通過檢測Y染色體特異性序列，無創(chuàng)檢測可以準確的診斷出男性胎兒患者(例如嚴重的X連鎖疾病)。但cfDNA檢測出的胎兒性別有時會與超聲檢查和/或產前診斷的結果不一致。除了實驗室取樣錯誤和質控因素，可能的原因包括胎盤組織的分布不均、“容易混淆”的基因型。例如，超聲看到的外生殖器與核型提示男胎，cfDNA提示女性胎兒，要懷疑胎兒DNA部分不足，或者雙胎之一45,X停止發(fā)育。男胎妊娠中胎盤存在45,X的比例約為1/24000。而當超聲和核型分析顯示為女性胎兒，cfDNA提示男胎時，要懷疑胎盤中有男性細胞系嵌合、雙胎之男胎停育、母親異體輸血或移植。不過，如果超聲看到的外生殖器與核型及cfDNA結果不符，就要考慮性發(fā)育疾病。例如超聲顯示為女性胎兒，cfDNA和核型分析顯示男性，要考慮46，XY胎兒女性化疾病(如Smith-Lemli-Opitz綜合征，發(fā)病率1/20 000-1/40 000;雄激素受體缺乏，發(fā)病率在男性活產兒中占1/20000-1/64 000;5-α還原酶缺乏)。如果cfDNA檢測和核型分析提示女性胎兒，而超聲顯示男性，要考慮46,XX胎兒男性化疾病(如有一段隱藏的SRY序列，外源性雄激素，先天性腎上腺皮質增生，分泌雄激素的腫瘤)。
通過cfDNA檢測胎兒拷貝數(shù)變異(CNV)是最近一個有趣的討論話題。對于CNV的檢測有兩種類型：(1)對已知遺傳綜合征特定目標區(qū)域致病性CNV的檢測包，大小為1.5到30Mb;(2)全基因組CNV，大小在7～10Mb以上。大體結構正常、核型正常的胎兒中有1.7%存在CNV，與母體年齡無關，因此CNV是胎兒結構正常的年輕孕婦存在胎兒染色體畸形的主要危險因素。
作者觀點
胎兒胎盤嵌合是cfDNA檢測結果與實際情況不符的主要生物學原因之一，性染色體的嵌合比例更高，同一胎盤中可以同時存在46,XX/47,XXX/45,X三種細胞系。而對于CNV，人群中廣泛篩查存在著局限性和缺點。對于CNV胎兒胎盤不一致的數(shù)據(jù)很有限。絨毛中結構重排嵌合的發(fā)生率為0.4%(243/60347)，在那些累及細胞滋養(yǎng)細胞的病例中(1型、3型嵌合)，胎兒累及率為19%(21/110)。其中47+標記染色體、不平衡重排和平衡重排的胎兒受累率分別為41.2%(14/34), 10.6%(7/66)和0%(0/10)。很難確定通過cfDNA進行全基因組CNV檢測會有多少假陽性的病例，但一定會占相當比例。另有一些絨毛嵌合只累及間質核心，47+標記染色體、不平衡重排和平衡重排的TFM分別占25.8%(8/31)、7.9%(6/76)、19.2%(5/26)。而不累及細胞滋養(yǎng)細胞的TFM在cfDNA檢測時會呈現(xiàn)假陰性。根據(jù)粗略和保守估計，如果考慮不平衡重排，8%表面平衡的重排和13%的47+標記染色體因標記染色體存在常染色質序列而有不良結局，因此不累及細胞滋養(yǎng)細胞的TFM造成的假陰性約為2.4%。
此外還有其他問題。首先，有一項對175000個高危妊娠進行CNV-cfDNA篩查的研究，但在普通人群中缺乏驗證。一些回顧性研究選擇的樣本是已經知道結局的，但無法準確計算檢出率與FPR，因為部分病例檢測了核型，但是沒有CMA結果。其次，cfDNA用于CNV的臨床意義有限。致病性CNV的檢測包只能檢測所有致病性CNV的10%，而7～10Mb的CNV檢測能發(fā)現(xiàn)20～30%，胎兒仍然有很大的殘余風險。并且，如果CNV片段較大，超聲上往往會有異常表現(xiàn)。第三，篩查的陽性預測值低。如果進行全基因組CNV的cfDNA檢測，有三個原因可能造成假陽性：(1)片段化的基因組可能導致CNV的無限聯(lián)合;(2)大約3.4%的胎兒CMA結果意義不明，這些臨床意義不明確(VOUS)的CNV使遺傳咨詢和做決定更加困難，cfDNA用于CNV篩查會增加不必要的有創(chuàng)檢查;(3)母親的惡性腫瘤可能導致假陽性結果。
從胚胎發(fā)育學上來看，孕11周之前進行cfDNA檢測的臨床價值很有限。這個孕周“自然選擇”在起作用，全面的超聲能夠發(fā)現(xiàn)問題，而孕婦可能過于看重cfDNA的陰性結果而忽略了超聲對其他染色體的價值。此外，羊水檢查要孕15周后進行，等待中的焦慮情緒也是一個問題。在血清學篩查后進行cfDNA檢測的策略里，加快報告時間才是有意義的。
總結與展望
隨著對胎盤生物學的復雜性和飛速發(fā)展的分子診斷技術的不斷認識，需要向孕婦提供更為全面和詳細的產前遺傳咨詢，充分篩查、診斷以及cfDNA檢測的優(yōu)點和局限性。
產前cfDNA檢測應用的“質量”應當重于“數(shù)量”。重點應在：(1)檢測流程的簡單化、自動化和標準化，降低費用并改善質量;(2)開展有統(tǒng)計學意義的臨床前瞻性驗證研究;(3)提高cfDNA檢測的準確性，包括提交每一份樣本的胎兒DNA比例、建立確定胎兒比例的金標準，以及對胎兒比例<>
文獻引自：F.R.Grati.Implicationsof fetoplacental mosaicism on cell-free DNA testing: a review of a common biologicalphenomenon. Ultrasound Obstet Gynecol 2016; 48:415-423.
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