I
2011年春天，加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna（詹妮弗·杜德納）教授前往波多黎各參加當(dāng)年的美國微生物學(xué)會年會。會議第二天下午她與好友John van der Oost 一起去一家咖啡廳喝咖啡，而正是在那里她遇見了一位穿著時(shí)尚的女科學(xué)家Emmanuelle Charpentier (艾曼紐·卡彭特)。詹妮弗大概怎么也不會想到，正是這一次相逢，改變了她的整個(gè)職業(yè)生涯。
詹妮弗第一次聽到CRISPR這個(gè)詞是2006年的時(shí)候。在與Jill Banfield教授的一次商議學(xué)術(shù)合作的通話中，Jennifer 聽到一個(gè)發(fā)音類似Crisper的東西，Jill并沒有解釋這個(gè)詞的含義，甚至連這個(gè)單詞怎么拼寫都沒提，她只是說想尋求該方面研究合作。Jill說CRISPR與RNAi之間可能存在著某種共性，而Jennifer課題組當(dāng)時(shí)主要的研究領(lǐng)域正是RNAi。Jennifer也非常爽快的答應(yīng)她下周在學(xué)校圖書館旁邊的咖啡廳見面商議合作的事宜。
當(dāng)天Jennifer來到那家咖啡廳的時(shí)候Jill早已在那里等候。她面前放著一個(gè)筆記本和幾篇論文。簡單的閑聊后她便開始在筆記本上畫起了草圖。
CRISPR序列 來源: Jennifer Doudna
這串由菱形和正方形構(gòu)成的區(qū)域便是CRISPR了。每一個(gè)菱形所代表的區(qū)域有著相同的堿基序列，而正方形區(qū)域的序列卻各不相同。Jennifer立即明白了CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，常間回文重復(fù)序列叢集）的含義。當(dāng)Jennifer問Jill該序列的功能時(shí)Jill回答：不是很清楚。她同時(shí)也說道大概有一半的細(xì)菌以及幾乎所有的古細(xì)菌基因組中都會存在該序列。很顯然如果該序列如此廣泛，它對細(xì)菌和古菌正常功能的維持也一定扮演著非常重要的角色。
接下來Jill拿出那幾篇論文，興奮地為Jennifer總結(jié)這幾篇論文所完成的工作。2005年三個(gè)獨(dú)立課題組均發(fā)現(xiàn)CRISPR重復(fù)序列間的間隔序列與某些噬菌體的DNA片段完全匹配，而且CRISPR中與噬菌體DNA片段匹配的數(shù)量越多，細(xì)菌受噬菌體感染的風(fēng)險(xiǎn)也就越低。很明顯CRISPR可能是細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)的重要組分，用以防御噬菌體的侵入。最后，Jill給Jennifer看了Kira Makarova 和 Eugene Koonin等人發(fā)表的最新的一篇文章，該文章也提出了CRISPR的適應(yīng)性免疫功能的假設(shè)。
很長一段時(shí)間內(nèi)，Jennifer一直從事RNAi功能的研究，而現(xiàn)在看來CRISPR有著與RNAi相似的功能。對于Jennifer來說，CRISPR這一研究課題的誘惑力實(shí)在是太大了。并且她認(rèn)為當(dāng)時(shí)的時(shí)點(diǎn)對于她來說也非常有利：雖然已經(jīng)有人提出了關(guān)于CRISPR功能的理論，但并沒有人能夠完全驗(yàn)證并且解析完整的作用機(jī)制，而她作為資深的分子生物學(xué)家做這方面的工作自然是得心應(yīng)手。
但Jennifer一時(shí)卻難以找到合適的人來做這方面的研究。Blake Wiedenheft的適時(shí)出現(xiàn)解決了她的難題。當(dāng)時(shí)Blake正申請前往Jennifer課題組做博士后研究工作。當(dāng)Jennifer問及他感興趣的研究方向時(shí)，Blacke回了一句：你聽說過CRISPR么？大概沒有比Blake更合適的人選了吧。
于是Jennifer組的CRISPR項(xiàng)目就這樣開始了。在Blake剛加入新實(shí)驗(yàn)室不久時(shí)，丹麥的生物公司Danisco就已經(jīng)驗(yàn)證了CRISPR的功能正是細(xì)菌的特異性免疫。隨即Stan Brouns等人報(bào)到了RNA在CRISPR系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用：CRISPR會先整體轉(zhuǎn)錄為RNA，再由酶剪切為具有單個(gè)重復(fù)序列/間隔序列的小片段，再與病毒DNA結(jié)合。而西北大學(xué)的Erik Sontheimer也發(fā)現(xiàn)了CRISPR RNA能夠通過DNA-RNA配對來誘導(dǎo)DNA降解。
Blake和Jennifer在為這些新發(fā)現(xiàn)感到興奮的同時(shí)，也認(rèn)識到仍有太多的基礎(chǔ)問題尚未解決。首先他們需要解析病毒DNA整合進(jìn)入CRISPR序列以及CRISPR轉(zhuǎn)錄及RNA片段剪切的過程，其次他們也需要解析CRISPR RNA誘導(dǎo)病毒DNA降解的過程。于是他們將目光擴(kuò)大到了CRISPR相關(guān)基因cas。
Cas基因 來源：Jennifer Doudna
cas基因的發(fā)現(xiàn)對于理解CRISPR功能具有重要貢獻(xiàn)。2002年Jansen首次在公開發(fā)表的文章中使用CRISPR這一名詞，通過生物信息學(xué)計(jì)算分析了CRISPR序列的特征并鑒定了4個(gè)CRISPR相關(guān)基因（CRISPR associated system, cas） cas 1-4。cas基因全都與CRISPR基因位點(diǎn)相鄰，提示兩者可能存在功能上的相關(guān)性。而且Cas蛋白同時(shí)具有螺旋酶和核酸酶結(jié)構(gòu)域，表明他們可能參與DNA代謝以及基因調(diào)控過程。
為了研究Cas蛋白的功能，Blake首先通過基因工程技術(shù)獲得了大量Cas1蛋白。在得到Cas1蛋白之后他通過一系列的實(shí)驗(yàn)揭示了該蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)Cas1蛋白能夠剪切DNA片段以使病毒DNA序列能夠嵌入到CRISPR序列中。此時(shí)，Rachel Haurwitz也加入了該項(xiàng)研究，并參與了Cas 6的研究，確定了Cas 6的功能為剪切已轉(zhuǎn)錄的長鏈CRISPR RNA。之后他們解析了越來越多的Cas蛋白功能，但這些蛋白與Cas1或Cas6的蛋白功能都非常相似。
到了2011年，組內(nèi)的多位老成員也加入了CRISPR戰(zhàn)隊(duì)。此時(shí)Blake和Jennifer的興趣已經(jīng)逐漸由剪切CRISPR DNA/RNA的Cas蛋白轉(zhuǎn)向了剪切病毒DNA序列的Cas蛋白。他們與John組的合作研究卻發(fā)現(xiàn)剪切病毒DNA的過程極其復(fù)雜，需要多個(gè)Cas蛋白來靶向和剪切病毒DNA：首先CRISPR RNA會與大約10個(gè)Cas蛋白形成能夠靶向需要剪切的病毒DNA序列的復(fù)合體，緊接著Cas3會剪切目標(biāo)DNA序列。之后Jennifer又與其他組合作解析出了識別剪切序列復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，并確定了堿基配對在識別過程中的重要作用。而立陶宛的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室也確定了Cas3蛋白的剪切方式：Cas3并不是一次剪切完成，而是將其剪切為數(shù)百個(gè)DNA片段。
隨著研究的深入，科研人員也逐漸認(rèn)識到CRISPR系統(tǒng)的極高的多樣性。一般而言CRISPR系統(tǒng)被分為兩大類，六個(gè)組，19個(gè)亞組。而2011年之前Jennifer組的研究只集中于第一類，對于第二類CRISPR如何剪切DNA的，她卻知之甚少。此時(shí)的她進(jìn)入了研究的瓶頸期。
II
2011年初，Jennifer在美國微生物學(xué)會年會上遇見了Emmanuelle Charpentier。當(dāng)John向她介紹Emma時(shí)，她立即想起了她的學(xué)生提到的Emma在瓦赫寧根的會議上關(guān)于tracrRNA的精彩報(bào)告。Emma從2000年初就一直對CRISPR很感興趣，她通過與馬普所的J?rgVogel合作對化膿性鏈球菌內(nèi)的小RNA進(jìn)行測序，并發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌內(nèi)tracrRNA的含量異常豐富。通過生物信息學(xué)分析他們預(yù)計(jì)編碼該RNA的基因序列與CRISPR位點(diǎn)臨近，并推測其可能影響CRISPR的功能。之后的一系列實(shí)驗(yàn)表明該系統(tǒng)具有三個(gè)組分：CRISPRRNA，Csn1蛋白，以及tracrRNA。
左：JenniferDoudna；右：Emmanuelle Charpentier
然而該系統(tǒng)的作用機(jī)制她卻并不清楚，與Jennifer合作會是她比較明智的選擇。Jennifer對這次合作感到非常興奮，此前她并沒有涉足過第二類CRISPR系統(tǒng)的研究，而這次的合作為她的工作提供了新的方向。她迅速指定組里的博后Martin Jinek，以及來自德國的碩士交換生Michael Hauer作為參與者，Emma組的博士生Krzysztof Chylinski也加入了該研究項(xiàng)目。
其實(shí)在第一次與Emma交談的過程中Jennifer就已經(jīng)意識到Csn1的重要作用。Csn1蛋白就是后來為人們熟知的Cas9。早在2007年Rodolphe和 Philippe等人就報(bào)道了Cas9能夠抵御嗜熱鏈球菌的病毒感染，Josiane 和 Sylvain等人的工作也發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白失活會影響病毒DNA的剪切過程。Emma的課題組則發(fā)現(xiàn)cas9基因突變會影響CRISPRRNA的生成，并導(dǎo)致整個(gè)免疫過程受損。Virginijus Siksnys等人的研究更進(jìn)一步，他們發(fā)現(xiàn)Cas9是嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)中唯一起重要作用的Cas蛋白。越來越多的證據(jù)顯示Cas9在第二類CRISPR系統(tǒng)中病毒DNA剪切過程中具有非常重要作用。
然而如何解析該CRISPR體系的作用機(jī)制呢？很明顯，第一步是弄清楚Cas9的功能，與之前的工作類似，首先要做的是Cas9蛋白的提取和純化工作。Krzysztof把含有cas9基因的人工染色體寄給了Jennifer組，由她們組來完成該項(xiàng)任務(wù)。由于Martin此時(shí)正忙于尋找教職，他只能指導(dǎo)Michael完成蛋白的純化。但當(dāng)Michael將Cas9，CRISPRRNA以及相應(yīng)的病毒DNA混合之后，他卻發(fā)現(xiàn)Cas9無法剪切病毒DNA，而此時(shí)Michael在該實(shí)驗(yàn)室交流的期限也到了，他只得悻悻的回到德國準(zhǔn)備畢業(yè)。
在Michael回國前夕，Martin終于在蘇黎世大學(xué)順利找到了教職并接替了Michael。他與Krzysztof順利找到了Michael實(shí)驗(yàn)失敗的原因：tracrRNA的缺失。經(jīng)過夜以繼日的工作，Cas9剪切過程的全貌逐漸浮出水面：首先Cas9需要結(jié)合到病毒DNA上，并打開DNA的雙鏈?zhǔn)笴RISPRRNA能與DNA的一條單鏈進(jìn)行堿基配對，配對成功則會誘導(dǎo)Cas9的兩個(gè)核酸酶功能模塊同時(shí)剪切兩條DNA單鏈，使DNA斷裂。隨著CRISPR RNA的變換，該系統(tǒng)幾乎可以剪切所有能夠與CRISPRRNA配對的病毒DNA序列。
那么Cas9能不能剪切除病毒DNA序列外的其他DNA序列呢？如果可以的話CRISPR將可能成為新的基因編輯工具?；蚓庉嬵I(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有的基于TALE和鋅指蛋白的核酸酶有著嚴(yán)重的局限性。主要的問題在于蛋白與DNA序列的配對效率太過。而Cas9蛋白剪切只需要CRISPRRNA和病毒DNA序列的配對就能完成剪切，如果Cas9能夠作為基因編輯工具剪切其他類型的DNA序列，那么Cas9將會給基因編輯領(lǐng)域帶來革命性的變革。
為了簡化基因編輯系統(tǒng)，Martin將CRISPR RNA與TracrRNA連接形成一條嵌合RNA鏈。接下來為了驗(yàn)證該系統(tǒng)的剪切病毒DNA之外的能力，他選擇了綠色熒光蛋白（GFP）中由20個(gè)堿基組成的5個(gè)不同序列，并且獲得了能夠與之配對嵌合RNA。在將RNA與Cas9和GFPDNA混合之后，不出所料，所有的GFP DNA都能在所設(shè)定的位點(diǎn)被完美的剪切。
2012年6月8日，Jennifer和Emma向科學(xué)雜志提交了論文，僅在二十天之后該文章就被接收?？v使她們很清楚這篇文章會對基因編輯領(lǐng)域產(chǎn)生巨大沖擊，她們也從不曾料想到CRISPR會掀起如此的驚濤巨浪。
III
Jennifer與Emma的文章為CRISPR作為基因編輯工具的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但該文章僅驗(yàn)證了該系統(tǒng)剪切游離GFPDNA的能力，而CRISPR系統(tǒng)能否在細(xì)胞內(nèi)剪切DNA，成了另一個(gè)急需驗(yàn)證的問題。于是Martin和Jennifer一刻也不敢停，立即開始了該方向研究。首先Martin將編碼Cas9和向?qū)NA的DNA序列分別轉(zhuǎn)入兩個(gè)質(zhì)粒中并將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)錄則能夠生成Cas9蛋白和向?qū)NA，并在細(xì)胞內(nèi)剪切DNA。由于已有研究表明ZFN可以在人胚胎腎細(xì)胞系HEK293成功編輯CLTA基因，因此他們選擇了同樣的基因，同樣的細(xì)胞，以便對比兩種基因編輯方式的優(yōu)劣。
然而早在Jennifer和Emma的文章發(fā)表之前，很多人就已經(jīng)預(yù)計(jì)到CRISPR的巨大潛力，這其中就包括張鋒和Geroge Church。張鋒出生于1982年，是哈佛-麻省理工布羅德研究所（Broad Institute of Harvard and M.I.T）最年輕的核心成員。他在斯坦福大學(xué)讀博士期間就幫助創(chuàng)建了光遺傳學(xué)工具，對神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了極為深遠(yuǎn)的影響。畢業(yè)之后，他回到了哈佛大學(xué)進(jìn)行基因編輯的研究，并成為了首位使用TALE來控制哺乳動物基因的科學(xué)家。
2011年一位訪問學(xué)者去羅德研究所做報(bào)告，而報(bào)告的主題正是關(guān)于細(xì)菌中適應(yīng)性免疫相關(guān)的CRISPR。他坐在報(bào)告廳的后排，當(dāng)時(shí)他的思緒并沒有集中到報(bào)告的內(nèi)容上，但CRISPR這個(gè)聽起來有點(diǎn)奇怪的名詞卻激起了他的興趣。他此前從未聽過CRISPR，在上網(wǎng)搜索相關(guān)資料的時(shí)候他卻變得越來越興奮。聽完那場報(bào)告之后的幾天他就前往邁阿密參加一場學(xué)術(shù)會議，但他完全沒有心思聽會議報(bào)告，一直窩在酒店房間里瀏覽CRISPR的相關(guān)資料。
所幸當(dāng)時(shí)已公開發(fā)表的文章并不多。由于之前發(fā)現(xiàn)CRISPR能夠?qū)褂绊懰崮讨圃斓牟《?，所以?dāng)時(shí)的應(yīng)用研究大都集中在酸奶制造行業(yè)。但張鋒卻有一個(gè)大膽的想法：他希望把CRISPR應(yīng)用到人類細(xì)胞上。雖然繼續(xù)從事基因編輯工具TALE的研究對他來說失敗的風(fēng)險(xiǎn)更小，但很顯然張鋒不是一個(gè)懼怕失敗的人。
左：張鋒；右：George Church
回所之后張鋒把他的想法告訴了他的學(xué)生從樂，而從樂立即明白了為什么張鋒對CRISPR感到如此興奮。此前他們使用的TALE需要繁瑣的蛋白合成過程，而且經(jīng)常合成完蛋白之后發(fā)現(xiàn)蛋白無法靶向到目標(biāo)DNA序列。但CRISPR不同，只需要RNA就能夠識別目標(biāo)DNA序列。如果說合成蛋白質(zhì)是建造一座摩天大廈，RNA的合成就像建造二層小樓那么簡單。
然而張鋒和從樂并沒有像Jennifer和Martin一樣從細(xì)菌開始研究，而是直接用人類和老鼠細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。如果想為醫(yī)療行業(yè)帶來革新的話，他們必須證明CRISPR在這些細(xì)胞中的潛力。兩人開始瘋狂的工作。當(dāng)時(shí)他們兩人的目標(biāo)有兩個(gè)：證明CRISPR能夠編輯動物細(xì)胞基因組，以及編輯之后的基因組能夠產(chǎn)生預(yù)期的功能。他們同樣選擇編碼GFP蛋白的基因作為基因編輯的對象。如果編輯之后能產(chǎn)生綠色熒光的細(xì)胞越少，則會證明CRISPR成功編輯的細(xì)胞越多。
張鋒和從樂當(dāng)時(shí)沒有意識到競爭的存在。2012年6月Jennifer和Emma的文章上線，該文章驗(yàn)證了CRISPR剪切游離DNA的能力，證明了CRISPR作為基因編輯工具的潛力。但張鋒并沒有因?yàn)檫@篇文章的出現(xiàn)而感到沮喪，因?yàn)榧羟杏坞xDNA與編輯動物細(xì)胞內(nèi)的基因組之間存在著巨大的差別。最后他們在Jennifer文章發(fā)表幾個(gè)月后完成了該課題的工作。2013年1月，張鋒組的文章在Science發(fā)表。他同樣也沒有意識到他之前的導(dǎo)師哈佛大學(xué)的George Church當(dāng)時(shí)也在做同樣的工作。George類似的工作也在同一期Science發(fā)表。
對于很多科學(xué)家而言知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)與發(fā)表文章同等重要。在2012年5月25日J(rèn)ennifer等人就提交了保護(hù)CRISPR技術(shù)的專利申請，七個(gè)月后的12月12日張鋒也提交了專利申請。由于申請了加快審核專利，張鋒在2014年4月第一個(gè)拿到了專利授權(quán)。2016年1月，Jennifer所在的加州大學(xué)要求對布羅德研究所的最早專利以及另外11項(xiàng)專利進(jìn)行專利干涉，從而引發(fā)了著名的CRISPR專利大戰(zhàn)。最終這場專利之爭以布羅德研究所勝出告終。
但我想對很多人而言，最重要的不是誰搶先發(fā)表文章，誰第一個(gè)拿到專利，最終哪幾個(gè)人拿到諾獎，大多數(shù)人關(guān)心的是CRISPR技術(shù)究竟會為科研，醫(yī)療，甚至大眾生活帶來哪些影響。從某些層面來講，這正是CRISPR必須拿諾獎的原因。我們將在下半篇中對此進(jìn)行詳細(xì)介紹。
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