環(huán)狀RNA是新的研究熱點(diǎn)之一，一石雙鳥：一個環(huán)狀RNA circ-Foxo3，兩篇paper（上）和（下），將分別介紹一個新環(huán)狀RNA分子circ-Foxo3的兩篇文章：
1. Foxo3circular RNA retards cell cycleprogression via forming ternary complexes withp21 and CDK2. Nucleic Acids Res（IF 9.1）. 2016 Feb 9.
2. Foxo3 circular RNA promotescardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress andsenescence responses. Eur Heart J（IF 15.2）. 2016 Feb 11。
題目：Foxo3 circular RNA retards cellcycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2
雜志：Nucleic Acids Research （IF 9.1）
時間：9/2/2016
研究團(tuán)隊：本文的通訊作者Burton B.Yang主要的研究胞外基質(zhì)及蛋白多糖的作用。環(huán)狀RNA是新的研究熱點(diǎn)，作者在今年二月份同時發(fā)表了兩篇circ-Foxo3的文章。本文提供了circRNA與蛋白結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用一個新的思路。接下來，我們會分享另一篇文章，看看臨床與基礎(chǔ)相結(jié)合的設(shè)計方式。
背景：
p21是周期素依賴激酶（CDKs）抑制劑，通過抑制CDKs復(fù)合物活性，來調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。環(huán)狀RNA包括，存在于胞漿中含有外顯子的circRNA，以及存在于胞核內(nèi)含有內(nèi)含子的ciRNA。而circRNA則充當(dāng)miRNA抑制劑，起到miRNA海綿的作用。因?yàn)閙iRNA在調(diào)控蛋白表達(dá)、細(xì)胞生理學(xué)上都起著很重要的作用，那么circRNA在細(xì)胞增殖、分化應(yīng)該也會起著重要的調(diào)控作用。
關(guān)于環(huán)狀RNA發(fā)揮microRNA“Sponge”作用的介紹，可參考第一季文章“聊基金系列·第四期: 環(huán)狀RNA （猜謎：一刀切完，只剩一段）”
作者發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)狀RNA：circ-Foxo3（由Foxo3基因編碼），它在非癌細(xì)胞中高表達(dá)，并與細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)。沉默掉circ-Foxo3之后，細(xì)胞增殖速度變快；高表達(dá)的circ-Foxo3能通過結(jié)合CDK2、p21來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。CDK2與周期蛋白A、E結(jié)合來促使細(xì)胞周期正常推進(jìn)，而p21則抑制這種作用關(guān)系來阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程。
主要內(nèi)容：
1、首先驗(yàn)證了circ-Foxo3的表達(dá)能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程；
實(shí)驗(yàn)表明，在非癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中circ-Foxo3和Foxo3水平成相反關(guān)系，而Foxo3能調(diào)控蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化；所以circ-Foxo3與細(xì)胞周期進(jìn)程、增殖應(yīng)該也相關(guān)；
接下來的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞匯合度越高，細(xì)胞周期受阻，處于G1期的細(xì)胞分布越高，其circ-Foxo3的表達(dá)越高；
用EGF（表皮生長因子，一種細(xì)胞增殖因子）處理后，circ-Foxo3的水平降低。反之，用EGF抑制劑處理后，細(xì)胞中的circ-Foxo3的水平增高。
*匯合度不僅僅是細(xì)胞的密度或鋪滿度，它也能夠反映細(xì)胞的生長狀態(tài)。如果匯合度過高，由于空間、營養(yǎng)物質(zhì)的限制，細(xì)胞的生長分裂都會受到抑制。
沉默circ-Foxo3后細(xì)胞增殖對應(yīng)于對照組或野生型細(xì)胞增加了，這表明：內(nèi)源性circ-Foxo3對細(xì)胞增殖能起到調(diào)控作用。
circ-Foxo3轉(zhuǎn)染細(xì)胞處于G1期的circ-Foxo3細(xì)胞分布要高于對照組，而S、G2期則該細(xì)胞分布要少很多。
用多個細(xì)胞系驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了circ-Foxo3的細(xì)胞生長要慢很多，絕大部分細(xì)胞都處于G1期。
所以，上述實(shí)驗(yàn)表明circ-Foxo3能抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。
2、前期報道，CDK2通過結(jié)合周期蛋白來推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，而p21則可以抑制這種作用關(guān)系，來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。所以，作者想了解circ-Foxo3是如何起作用來影響細(xì)胞周期進(jìn)程的。
分別用circ-Foxo3以及線性Foxo3探針，去結(jié)合一些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，然后分別用這些蛋白的抗體去沉淀circ-Foxo3、Foxo3。作者發(fā)現(xiàn)CDK2和p21抗體下拉circ-Foxo3特別明顯，而線性Foxo3則未被拉下。轉(zhuǎn)染circ-Foxo3的細(xì)胞，CDK2、p21抗體能拉下更多的circ-Foxo3。
后期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，能被CDK2、p21抗體大量沉淀下來circ-Foxo3的細(xì)胞主要處于G1期。這也可以驗(yàn)證了第一部分的結(jié)果：circ-Foxo3能在G1期阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。
這表明CDK2、p21與其他的實(shí)驗(yàn)對象有很大的不同，這有可能是CDK2、p21在circ-Foxo3介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程中起著很重要的作用。
3、驗(yàn)證circ-Foxo3通過與CDK2、p21形成三聚體來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。
作者用CDK2、p21并不能拉下其他的一些circRNA，這說明circ-Foxo3與CDK2、p21的是一種特異性的結(jié)合關(guān)系。
CDK2本身能夠與周期蛋白A、E結(jié)合，p21能阻止它們的結(jié)合作用。在circ-Foxo3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CDK2抗體去沉淀周期蛋白A、E時，沉淀下來的量很少。而分別用周期蛋白A、E的抗體去沉淀CDK2，同樣發(fā)現(xiàn)沉淀下來的CDK2很少。這表明，存在circ-Foxo3的同時，p21能增強(qiáng)抑制CDK2結(jié)合周期蛋白。
之前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，circ-Foxo3主要存在于細(xì)胞的G1期中。作者猜測由circ-Foxo3介導(dǎo)的CDK2、p21作用是否就發(fā)生在G1期。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，只有在G1期中，CDK2抗體能沉淀大量的p21，p21也只有在G1期中能沉淀大量的CDK2。
這就可以表明了，circ-Foxo3、CDK2、p21是形成了一個三聚體來發(fā)揮作用。作者用梯度凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了他們的結(jié)合關(guān)系。
4、對上述的三元復(fù)合物是抑制細(xì)胞周期進(jìn)程原因進(jìn)行反向驗(yàn)證，確定阻止三元復(fù)合物的形成是否能推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。
沉默掉circ-Foxo3后，相對于對照組，p21抗體拉不到CDK2，同樣CDK2抗體也拉不到p21。而周期蛋白A、E抗體能夠沉淀更多的CDK2。說明，在circ-Foxo3缺失的情況下，CDK2恢復(fù)了與周期蛋白A、E結(jié)合作用。免疫印跡實(shí)驗(yàn)也表明，在該實(shí)驗(yàn)組情況下，形成的p21-CDK2復(fù)合物不明顯。
沉默掉p21后，相對于對照組，p21抗體沉淀circ-Foxo3減少了。而circ-Foxo3的總水平并未改變。這說明p21與circ-Foxo3作用，p21量少了，拉下來的circ-Foxo3也少了。沉默掉CDK2后，同樣并不影響circ-Foxo3表達(dá)量。相對于對照組，用CDK2抗體沉淀的circ-Foxo3水平降低了（同理），并且CDK2沉淀下來的p21、CDK2量都減少了。而用p21抗體沉淀，只有CDK2的沉淀水平降低，circ-Foxo3水平保持不變。這說明circ-Foxo3、p21、CDK2形成了一個三聚體，介導(dǎo)p21、CDK2作用。
5、確定circ-Foxo3和CDK2、p21的結(jié)合作用。
作者使用酵母雙雜實(shí)驗(yàn)，在circ-Foxo3轉(zhuǎn)染細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)中，可以用circ-Foxo3探針將CDK2、p21都沉淀下來。同樣證明它們之間的作用關(guān)系。
沉默了circ-Foxo3后，拉下來的circ-Foxo3蛋白明顯減少。并且被拉下來的p21、CDK2蛋白水平也更低。
p21沉默細(xì)胞中，circ-Foxo3探針只能沉淀很少的p21，但CDK2沉淀水平?jīng)]有變。而恢復(fù)p21水平，對circ-Foxo3-CDK2作用不起變化，所以除了三聚體外還存在一個circ-Foxo3-CDK2復(fù)合物。而沉默掉CDK2，circ-Foxo3探針沉淀CDK2水平降低，而沉淀p21水平不變。
6、p21、CDK2的結(jié)合位點(diǎn)的保護(hù)機(jī)制驗(yàn)證
RNAse A能夠降解蛋白中的RNA。作者通過用不同濃度的RNAse A處理circ-Foxo3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在低濃度時出現(xiàn)兩條帶。而高濃度的RNAse A能夠徹底破壞三元復(fù)合體。
過表達(dá)circ-Foxo3細(xì)胞，無論是否加入RNAse A孵育，p21、CDK2抗體都能拉下高水平的p21和CDK2。如果轉(zhuǎn)入的是空質(zhì)粒，則p21抗體拉不到CDK2，CDK2抗體也拉不到p21。說明了，circ-Foxo3與p21、CDK2結(jié)合作用，阻止了RNAseA結(jié)合circ-Foxo3的位點(diǎn)使得circ-Foxo3降解。
用不同匯合度的細(xì)胞去驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在匯合度高的時候，用低濃度RNAse A處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)兩個條帶。說明了，該作用發(fā)生在細(xì)胞生長受阻或停滯的情況下。
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