最近，2016國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目結(jié)果已經(jīng)公布，數(shù)據(jù)顯示circRNA已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)，與circRNA相關(guān)的項(xiàng)目共獲批63項(xiàng)，而去年只有13項(xiàng)。且今年獲批的項(xiàng)目中針對(duì)circRNA表達(dá)量或功能研究的明顯增多，說明circRNA研究已過渡到功能研究上。
前幾天小編已經(jīng)給大家簡單綜述了有關(guān)circRNA研究的相關(guān)內(nèi)容（可以點(diǎn)擊文末閱讀原文查看），我們復(fù)習(xí)一下要點(diǎn)：circRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，目前研究認(rèn)為circRNA主要通過三種機(jī)制發(fā)揮作用（1）順式調(diào)控親本基因的表達(dá)；（2）作為miRNA的海綿吸附體調(diào)控基因的表達(dá)（ceRNA）；（3）通過和蛋白形成復(fù)合體來發(fā)揮生物學(xué)功能[1]。
下面，我們將通過案例為大家詳細(xì)講解，如何開展circRNA的ceRNA調(diào)控機(jī)制研究。
研究案例：
一、研究思路
二、研究結(jié)果
1、正常組織及癌組織的circRNA分析
納入6個(gè)正常組織 (brain, heart, liver,lung, colon and stomach)、1對(duì)原發(fā)性肝癌的癌及癌旁組織、6個(gè)癌組織(CRC, GC, KCA, BLCA, BCand PRAD)進(jìn)行RNA-seq。共鑒定67,358個(gè)circRNAs，80%的circRNAs包含protein-coding exons，circRNAs的中位數(shù)長度為~500 nt，circRNAs在不同組織類型中存在不同的表達(dá)趨勢(shì)。qRT-PCR with RNase R treatment及sanger sequencing鑒定到20個(gè)新circRNAs。
2、circRNA特性分析
5,955個(gè)主基因共生成20,530 circRNAs，說明1個(gè)基因至少產(chǎn)生1個(gè)circRNA。然而對(duì)于1個(gè)基因，可能只有1個(gè)主效表達(dá)的circRNA。以5’ CR (circular ratio) > 0.2; 3’ CR > 0.2; SRPBM > 1為閾值，共篩選到990個(gè)高豐度circRNAs（circRNAs表達(dá)量顯著高于其線性），其中circHIPK3顯著富集。circHIPK3的表達(dá)量、穩(wěn)定性、定位、FISH分析表明：circHIPK3在人類細(xì)胞中高豐度且穩(wěn)定表達(dá)。
3、circHIPK3來源于HIPK3 exon2
為分析circHIPK3的形成機(jī)制，首先進(jìn)行比對(duì)分析，在HIPK3 circularizing exon左右2段各發(fā)現(xiàn)了一個(gè)repeated Alu elements。當(dāng)缺少1或2個(gè)Alu elements時(shí)，并不能形成環(huán)化，說明2個(gè)repeated Alu elements對(duì)于circHIPK3的形成是必需的。CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)表明：與Alu repeats互補(bǔ)long flanking introns對(duì)于circHIPK3的形成是必需的。
4、沉默circHIPK3可抑制細(xì)胞增值
分別采用siRNA及CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行l(wèi)oss-of-function研究，結(jié)果表明：circHIPK3的沉默可對(duì)細(xì)胞增值產(chǎn)生抑制作用。
5、circHIPK3是作為多個(gè)miRNA的“海綿”
基于前人研究及RIP結(jié)果，說明AGO2與circHIPK3存在互作關(guān)系。此外，熒光素酶活性分析說明：circHIPK3可能是一個(gè)AGO2和miRNAs的結(jié)合平臺(tái)。隨后，采用luciferase screening for a miRNA library驗(yàn)證miRNAs和circHIPK3的互作。其中，9 miRNAs (miR-124,miR-152, miR-193a, miR-29a, miR-29b, miR-338, miR-379, miR-584 and miR-654) 可降低熒光素酶活性，然而并沒有顯著降低circHIPK3的表達(dá)水平。雖然這些miRNAs中都包含至少一個(gè)circHIPK3的結(jié)合位點(diǎn)，但miRNAs的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)并沒有對(duì)熒光素酶活性產(chǎn)生影響，上述結(jié)果表明：circHIPK3可能是這些miRNAs的“海綿”。
miR-124, miR-193, miR-379 andmiR-654的過表達(dá)可顯著抑制HEK-293T細(xì)胞生長，其中miR-124表現(xiàn)出最明顯的抑制作用。circHIPK3 knockdown可誘導(dǎo)miR-124靶基因（IL6R和DLX2）的下調(diào)表達(dá)；circHIPK3過表達(dá)可削弱miR-124誘導(dǎo)的增值抑制作用。此外，進(jìn)行circHIPK3 and miR-124的組織特異性表達(dá)分析，其在腦組織中顯著高表達(dá)。綜述所述，circHIPK3通過直接結(jié)合miR-124來抑制其活性。
結(jié)論：
circHIPK3來源于HIPK3 exon2，且2個(gè)repeated Alu elements對(duì)于circHIPK3的形成是必需的。siRNA及CRISPR/Cas9抑制circHIPK3的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增值。circHIPK3過表達(dá)可削弱miR-124誘導(dǎo)的增值抑制作用。circHIPK3通過直接結(jié)合miR-124來抑制其活性。
上述研究思路：從circRNA入手進(jìn)行ceRNA機(jī)制研究。后續(xù)將為大家解讀另一種研究思路：從miRNA入手進(jìn)行ceRNA機(jī)制研究，敬請(qǐng)期待~~~~
參考文獻(xiàn)
1. Jeck, W.R. and N.E. Sharpless, Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology,2014. 32(5): p. 453-61.
2. Zheng, Q., et al., Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulatescell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016. 7(11215).
來源：歐易生物
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