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Ribonuclease R (RNase R)是一種核糖核酸外切酶，廣泛應(yīng)用于circRNA的鑒定、富集和相關(guān)實(shí)驗(yàn)。筆者注意到很多研究人員在使用中碰到了一些問題和“奇怪”的現(xiàn)象，下面就來簡單的梳理一下，并在參考文章和資料的基礎(chǔ)上給出解釋和建議。

1 RNase R的功能

RNase R來源于大腸桿菌RNR超家族，可以從3’-5’方向切割降解RNA，能夠消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化呈環(huán)形的RNA、套索結(jié)構(gòu)或3’端突出末端少于7 nt的雙鏈RNA分子（Cheng ZF et al., 2002）。

圖1 RNase R消化RNA示意圖（吉賽生物）

2 RNase R的反應(yīng)體系

關(guān)于RNase R的具體使用量和反應(yīng)體系，不同參考文章里也有差別，常見的為10 μL或20 μL反應(yīng)體系，使用比例為3U RNase R/μg RNA，下圖是一個(gè)推薦的反應(yīng)體系。

圖2 RNase R消化反應(yīng)體系（吉賽生物）

3 什么時(shí)候用？

RNase R主要用于circRNA的鑒定和富集實(shí)驗(yàn)，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和目的來決定是否進(jìn)行RNase R消化。

3.1 circRNA的鑒定

circRNA的鑒定常使用RT-PCR（圖3, 4）和Northern blot實(shí)驗(yàn)（圖5，6），根據(jù)RNase R(+)和RNase R(-)組中是否檢測到條帶來證明檢測的分子是circRNA。

圖3 使用RT-PCR檢測mRNA，在RNase R(-)中有條帶，在RNase R(+)中無條帶；檢測Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)樣品中都有條帶，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）

圖4 RNase R消化后分別以Divergent Primer和Convergent Primer檢測cDNA樣品。RNase R(+)中Divergent Primer有條帶，Convergent Primer無條帶；RNase R(-)中Divergent Primer和Convergent Primer都有條帶，表明檢測的基因?yàn)閏ircRNA，并且耐受RNase R消化（Yibing Y et al., 2018）

RT-PCR中若要證明檢測的基因是否為circRNA，需要體現(xiàn)在RNase R(+)和RNase R(-)組中條帶有無和豐度高低有差異，這種情況是需要做RNase R消化的，也可以和分別使用Divergent Primer和Convergent Primer檢測cDNA和gDNA樣品的結(jié)果結(jié)合起來。如果是以qPCR進(jìn)行定量檢測，一般可以不做RNase R檢測，即不需要對circRNA進(jìn)行富集（線性RNA被消化），因?yàn)镈ivergent Primer和Convergent Primer基本可以保證檢測的特異性。

圖5 以3U RNase R/μg RNA 進(jìn)行RNase R消化15分鐘，電泳顯示RNase R(+)組中28S/18S條帶變淡。使用同時(shí)檢測circRNA和mRNA的探針進(jìn)行Northern blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示RNase R(+)組檢測不到線性的Gapdh、Phf21a、Elf2、Mfsd6、Stau2或Zfp609，可以檢測到對應(yīng)的circRNA，表明mRNA被消化，而circRNA耐受消化（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）

圖6 RNase R消化產(chǎn)物電泳顯示RNase R(+)組中28S/18S/5S條帶變淡。Northern blot檢測顯示RNase R(+)組中無線性GAPDH的條帶，CDR1as和hsa-circRNA 2/3/16能檢測到條帶，表明線性RNA被消化，而circRNA耐受消化（Memczak S et al., 2013）

Northern blot實(shí)驗(yàn)使用探針特異性檢測內(nèi)源的circRNA和線性RNA，過程中無PCR擴(kuò)增，能夠真實(shí)地反映circRNA和線性RNA的定性定量分析結(jié)果，是circRNA鑒定中必不可少的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。

3.2 circRNA的富集

高通量測序時(shí)常需要對circRNA進(jìn)行富集，此時(shí)RNase R消化就是必須的。為探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相關(guān)基因的變化，可以同時(shí)做RNase R(+)和RNase R(-)組樣品的測序。筆者實(shí)驗(yàn)室的測序顯示RNase R(+)組中junction reads相對于RNase R(-)樣本有5-10倍的富集，可鑒定出幾千到上萬個(gè)circRNAs。

圖7 RNase R(+)和RNase R(-) RNA測序示意圖（Jeck WR et al., 2014）

4 RNase R消化的效果

Total RNA經(jīng)消化后直接進(jìn)行電泳檢測，RNase R(-)組中28S/18S/5S三條帶單一明亮，而RNase R(+)組中28S/18S/5S條帶會變淡或不可見（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）。但如果RNase R+組中5S條帶加亮，且28S/18S條帶處有拖尾，則可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化產(chǎn)生的，如不能確定降解是發(fā)生在電泳過程中還是RNase R消化反應(yīng)中，可以嘗試在RNase R消化反應(yīng)體系中加入RNase inhibitor。

a圖

b圖

圖8 a, RNase R消化后條帶變淡；b, RNase R消化后條帶不可見（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）

5 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和常見問題

5.1 測量濃度

實(shí)驗(yàn)中要先對total RNA測量濃度，以計(jì)算相應(yīng)的比例和使用量來進(jìn)行RNase R消化。消化后的產(chǎn)物無需測量濃度，實(shí)際上因?yàn)榉磻?yīng)體系內(nèi)的蛋白質(zhì)、鹽離子等成分影響，測量到的濃度也不會準(zhǔn)確。

5.2 純化回收

經(jīng)RNase R消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA純化柱和磁珠進(jìn)行純化回收。經(jīng)RNase R消化后直接進(jìn)行RT-PCR的，一般可以不做純化，酶失活后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)即可（Legnini I et al., 2017; Guarnerio J et al., 2016）。

注：苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，沒有試劑也可以Trizol Reagent代替。

5.3 RNase R消化反應(yīng)溫度和時(shí)間

RNase R消化一般于37℃進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間10-30 min為宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推薦過長時(shí)間的消化。另外檢測不同的基因可能也需要摸索反應(yīng)時(shí)間，筆者實(shí)驗(yàn)室直接用于RT-PCR檢測時(shí)常用5-15 min消化就能得到很好的結(jié)果，線性基因豐度可以降低幾十到幾百倍，circRNA豐度則基本不變。

經(jīng)RNase R消化后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的，推薦在37℃反應(yīng)結(jié)束后保持70℃ 10 min使RNase R滅活（Cheng ZF et al., 2002）。如果消化后要進(jìn)行純化回收，也可以不做酶的失活。

5.4 qPCR定量計(jì)算

RNase R消化后不能再使用ACTB或GAPDH作為內(nèi)參，此時(shí)可以將原始的RNA等分為兩份，一份進(jìn)行RNase R處理（RNase R(+)），另一份不處理（RNase R(-)），統(tǒng)一以RNase R(-)組中的內(nèi)參為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)（Zhang Y et al., 2016）。

另外在RNase R消化后如果進(jìn)行純化回收，RNA的濃度可能會有變化，不適宜再以RNase R(-)組中的內(nèi)參為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。此時(shí)可以在純化回收前加入少量其他物種的RNA作為外參，統(tǒng)一以外參標(biāo)準(zhǔn)化樣品后進(jìn)行計(jì)算（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Pamudurti NR et al., 2017）。

5.5 circRNA也被消化？

實(shí)驗(yàn)中有時(shí)會發(fā)現(xiàn)經(jīng)RNase R消化后部分circRNA豐度也有明顯降低，此時(shí)要檢查消化反應(yīng)體系有無問題，考慮是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA在經(jīng)長時(shí)間RNase R消化也會豐度降低，可能是因?yàn)槠淠褪躌Nase R消化力弱（Zhang Y et al., 2016）。

圖9 RNase R消化0-120 min，檢測circCAMSAP1在15 min時(shí)就被明顯消化（Zhang Y et al., 2016）

圖10 RNase R消化后進(jìn)行qPCR檢測，RNase R組中has-circRNA 2/3/6/9/16和CDR1as豐度有輕微降低，但和GAPDH相比，circRNAs顯示有不低于10倍的耐受RNase R消化力（Memczak S et al., 2013）

筆者實(shí)驗(yàn)室也經(jīng)常會檢測到RNase R消化后circRNA豐度會降低的情況，一般縮短消化時(shí)間可以減少circRNA被消化的可能，另外對比線性RNA和circRNA消化后豐度降低的倍數(shù)，是明顯能看到circRNA比線性RNA耐受消化的。