長鏈非編碼（long non-coding RNA，LncRNA）在疾病研究中大放異彩，解析LncRNA的分子結構，深入研究其在生物體生理及病理過程中所發(fā)揮的作用，并揭示作用機制，對于加深生物體生理及病理過程的認識，疾病的診斷、防治等具有重要意義。
近期，安諾優(yōu)達與中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院合作，在Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research（IF：4.5）上聯(lián)合發(fā)表的文章，揭示了lncRNA在上皮間質轉化（EMT）中全局變化及相關調控機制。
目前l(fā)ncRNA 研究如此火熱，實驗方案該如何設計？測序數據如何挖掘？文章怎么寫呢？下面小編就以這篇文章為例，聊一聊怎樣利用測序數據發(fā)表3-5分的lncRNA文章。
研究背景
上皮間質轉化（EMT）是腫瘤轉移的重要步驟，研究表明lncRNA在EMT過程中發(fā)揮重要作用，但機制尚未可知。
圖1 研究思路
結果展示
EMT期間 lncRNA及mRNA差異表達分析
選取MCF10A細胞TGF-β處理后0h，8h，24h或72h 不同時間點，構建去rRNA文庫進行全轉錄組測序。鑒定出9282個已知mRNA，4961個已知lncRNA以及8703個novel 基因，且在EMT過程中l(wèi)ncRNA表達水平變化顯著高于mRNA，可能發(fā)揮更關鍵的調控作用。
圖2 EMT過程中mRNA（左）和lncRNA（右）差異表達聚類熱圖
novel lncRNA以及circRNAs的鑒定及qRT-PCR驗證
本研究共鑒定出512個novel lncRNA，2208個circRNA，其中大量circRNA在EMT過程中有2倍以上差異表達，可能參與調控EMT。qRT-PCR驗證表達趨勢一致。
圖3 EMT過程中l(wèi)ncRNA和circRNA鑒定及qRT-PCR驗證
lncRNA-mRNA關聯(lián)分析，鑒定關鍵lncRNA
LncRNA-mRNA共表達網絡顯示3個lncRNA位于5個獨立的網絡節(jié)點之間，可能發(fā)揮重要的調控作用。應用RNAi技術沉默3個lncRNA，發(fā)現(xiàn)沉默掉RP6-65G23.5后上皮標記物顯著下調，間充質標記物顯著下調。結果表明，RP6-65G23.5可能在EMT過程中發(fā)揮關鍵調控作用。
圖4 lncRNA-mRNA關聯(lián)分析及關鍵lncRNA沉默實驗驗證
思路總結
應用RNA-seq技術同時對mRNA、lncRNA以及circRNA 3部分數據進行差異分析，通過設置不同時間點構建基因表達動態(tài)譜圖，找到關鍵時間點。構建共表達網絡，定位關鍵調節(jié)因子，進行后續(xù)實驗驗證及分子機制相關研究。
本文的亮點在于對多種RNA分子相關數據信息的分析及關鍵lncRNA調控因子的篩選，但對于lncRNA分子機制的研究方面不夠深入，有待進一步挖掘。
3-5分lncRNA文章套路主要為測序數據分析，關鍵RNA分子的篩選，qPCR驗證、過表達/敲除等分子實驗驗證3大模塊，其中關鍵RNA分子的篩選及鑒定為揭示分子機制的重要前提。
此外，完善的實驗驗證、分子機制的深入挖掘更是提升文章水平的關鍵，主要包括：基于ceRNA調控網絡，lncRNA靶點蛋白/miRNA篩選，上下游調控機制揭示等方面。以上是小編通過多篇lncRNA文章總結出的研究套路，套路摸清了，高分文章是不是就指日可待啦？
圖5 分子機制研究思路圖
安諾基因全轉錄組測序擁有豐富的項目經驗，全面的分析內容（多組學聯(lián)合+ceRNA分析）， 更綜合下游合作公司資源，涵蓋 lncRNA篩選、分子生物學鑒定、直接靶點篩查、生物學功能研究、lncRNA-蛋白-DNA/lncRNA-RNA等多項功能驗證研究，為您提供全面的一站式服務！
文獻來源：Jian-You Liao, Jue Wu, Yan-Jie Wang, et al. Deep sequencing reveals a global reprogramming of lncRNA tranome during EMT[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research.
文案：RNA產品經理 王亞男
設計：胡珊珊
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