每分鐘有7人被診斷為癌癥，惡性癌癥危及全球人類的健康。中國癌癥病人晚期比例遠高于美國，手術(shù)機會少，加上靶向藥有限，藥品價格昂貴，5年生存率遠低于美國。手術(shù)、放療、化療及靶向治療是目前腫瘤的主要治療手段，然而它們并未給晚期實體瘤患者帶來長期的生存獲益。而且其高昂的醫(yī)藥費用也讓很多家庭背上沉重的負擔，貧困家庭甚至無錢醫(yī)治。也許，癌癥治療本無需高昂費用，科學家正在挑戰(zhàn)癌癥治療現(xiàn)狀。
P53(TP53）基因是人類各種癌癥中最常出現(xiàn)突變的抑癌基因。
P53基因是人體一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene），位于17號染色體p13，全長16-20kb,含有11個外顯子，轉(zhuǎn)錄2.8kb的mRNA，編碼一種分子量為43.7KDa的P53蛋白質(zhì)，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白。因蛋白條帶出現(xiàn)在Marker所示53KDa處，命名為P53。p53基因的失活對腫瘤形成起重要作用。mdm2突變 與 P53突變不共存，p53是一個重要的抗癌基因，其野生型使癌細胞凋亡，從而防止癌變。P53還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。過去一直把它當成一種癌基因，直至1989年才知道起癌基因作用的是突變的p53，后來證實野生型p53是一種抑癌基因。
野生型P53蛋白在維持細胞正常生長、抑制惡性增殖種起著重要作用，因而被冠上“基因衛(wèi)士”的稱號。p53基因時刻監(jiān)控著細胞染色體DNA的完整性，一旦細胞染色體DNA遭到損害，P53蛋白與基因的DNA的相應結(jié)合部位結(jié)合，起特殊轉(zhuǎn)錄因子的作用，活化p21基因轉(zhuǎn)錄，使細胞停滯于G1期；抑制解鏈酶的活性；并與復制因子A相互作用，參與DNA的復制與修復。如果修復失敗，P53蛋白即啟動程序性死亡（凋亡）過程誘導細胞自殺，阻止有癌變傾向的突變細胞的生成，從而防止細胞惡變。
p53基因蛋白是讓全球腫瘤生物學家著迷
國際科學期刊《細胞》雜志發(fā)表了一項對p53進行深度研究的報告。p53蛋白能夠被多種應激刺激激活，同時它也控制著一個非常復雜的抗增殖轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，這一轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)影響到人體的無數(shù)生物反應。
p53蛋白(紫色和黃色)作為一種腫瘤抑制基因
p53是一種調(diào)控轉(zhuǎn)錄的序列特異性DNA結(jié)合蛋白。與p53介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在抑制腫瘤中的重要作用一致，大部分腫瘤中出現(xiàn)的TP53基因突變發(fā)生在編碼p53蛋白DNA結(jié)合域的部分。在正常細胞中，p53被一系列調(diào)節(jié)因子維持在低水平。其中MDM2基因作為p53泛素連接酶，能夠促進p53的降解。不過在多種細胞應激情況下p53蛋白在細胞中的穩(wěn)定性得到提高。激活p53的機制根據(jù)刺激的不同而改變，例如，DNA損傷會促進p53的磷酸化，從而阻斷MDM2媒介的降解。而致癌基因突變引發(fā)的信號通路會誘導ARF腫瘤抑制子抑制MDM2的功能。
p53促進細胞周期停滯(cell cycle arrest)和細胞凋亡(apoptosis)的功能。P53促進細胞周期停滯的目的是為了幫助DNA在進行更多細胞分裂之前獲得修復。同時，p53可以通過引導促進凋亡的BCL-2家族成員的表達來促使細胞凋亡的發(fā)生。
p53是一個重要的腫瘤抑制蛋白 。一方面，p53在DNA出現(xiàn)損傷后能夠引發(fā)細胞周期停滯或者消滅細胞，表明它可以通過預防致癌基因突變的累積來防止癌癥發(fā)生。從這個角度來說，p53缺失會導致存活下來的子細胞中基因突變數(shù)目增多，從而間接地促進癌癥的發(fā)生。另一方面，p53在致癌基因異常表達時能夠阻止細胞增殖，表明它可能在限制致癌基因突變的惡果方面也有重要作用。在這種情況下，p53缺失會允許表達致癌基因的細胞繼續(xù)無限制增殖，從而直接導致癌癥發(fā)生。不管從哪個角度看，p53都承擔著基因衛(wèi)士職責，它會限制基因突變帶來的有害后果。
“基因衛(wèi)士”P53。當DNA損傷發(fā)生時，DNA 損傷反應應激酶會磷酸化p53，激活p53，導致細胞周期停滯、細胞衰老或者細胞凋亡。這些步驟最終可以減少基因突變進一步傳播的風險。而且，p53會激活編碼DNA修復機制組成部分的基因，從而刺激DNA修復。
另一個功能p53可以通過殺死可能出現(xiàn)異常有絲分裂的細胞來限制染色體不穩(wěn)定性的產(chǎn)生，特別是在中心體擴增或端粒功能失常之后。多余的中心體可以導致Hippo信號通路的上調(diào)，這會通過抑制MDM2來激活p53。有研究表明p53缺失的細胞更容易耐受異?；騽┝吭斐傻牡鞍捉M方面的壓力。綜合這些原因，p53缺失似乎不但促進非整倍體細胞的產(chǎn)生，而且維持它們的存活。
另一個p53維持基因組完整性的手段是抑制反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的移動。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是病毒生成的遺傳元件，它們可能通過在基因組中的轉(zhuǎn)移和重新插入造成基因突變的產(chǎn)生。有研究表明在果蠅中激活可移動的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以導致DNA出現(xiàn)雙鏈斷裂，p53引發(fā)的細胞凋亡理論上可以減少DNA雙鏈斷裂帶來的基因突變的可能。但是p53基因突變與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達之間的關(guān)系并不只限于消滅出錯細胞。
p53 控制著一個廣泛而靈活的信號網(wǎng)絡
P53調(diào)節(jié)基因組完整性，細胞周期停滯和細胞凋亡，同時p53還控制更多“非經(jīng)典”信號通路。例如，p53可以調(diào)節(jié)自噬活動，改變新陳代謝，抑制多能性和細胞可塑性，并且協(xié)助依靠鐵離子的細胞死亡方式。即便是基準水平的p53也可以增強多種其它腫瘤抑制信號網(wǎng)絡。
p53信號網(wǎng)絡
TP53基因突變的多樣性導致不同的功能結(jié)果
TP53基因位點在腫瘤中的變異方面的研究，通過基因組測序已經(jīng)證實，大約一半腫瘤至少攜帶一個p53變異，但是不同類型的腫瘤之間攜帶p53變異的頻率和分布有非常大的差別。大多數(shù)在TP53基因中出現(xiàn)的 SNVs是錯義突變，其中25％屬于5種熱點突變。令人意外的是，大約25％的TP53突變是會導致編碼截短蛋白的無義或移碼突變，剩下的是剪接點SNVs和生理意義不明的片段插入或缺失。雖然有幾種渠道可以讓第二個TP53等位基因失活，但是這通常是由于片段刪除(segmental deletion)而造成的。這些被刪除的片段大小不一，出現(xiàn)的頻率和SNVs出現(xiàn)的頻率相當。大約只有25％的腫瘤攜帶著典型的p53錯義突變/片段刪除組合。
▲16種癌癥類型中的常見TP53突變
掌控p53信號網(wǎng)絡，抑制突變保持穩(wěn)定性
目前利用對p53生物學理解進行抗癌藥物研發(fā)中，進展最快的項目是抑制攜帶野生型p53的腫瘤中的MDM2。以Nutlin為首，一系列抑制MDM2和MDMX的小分子和肽基抑制劑被開發(fā)出來。它們通過靶向MDM2中與p53的結(jié)合位點來防止p53的降解。MDM2拮抗劑在白血病和脂肪肉瘤中已經(jīng)完成一系列臨床1期試驗。雖然這些劑量遞增試驗不能對藥物療效作出結(jié)論，但是在大多p53野生型樣本中觀察到了p53靶點基因的表達量增加。而且在5～10％的患者中觀察到了部分反應，這是一個好的預兆，因為這些患者中很多已經(jīng)接受過多種療法的治療。
▲p53治療策略：在p53野生型腫瘤中保持p53穩(wěn)定性
在另一種情況下，MDM2抑制劑被用來減少化療的毒副作用。在這種策略中，這些藥物被用來在正常細胞中提高p53的穩(wěn)定性，從而觸發(fā)暫時的細胞周期停滯。這一做法的目的是對于攜帶p53突變的腫瘤細胞來說這些藥物對細胞周期周轉(zhuǎn)沒有作用。因為細胞毒性藥物靶向積極分裂的細胞，這一策略可以提高化療藥物的使用劑量，在增強對分裂的癌細胞的療效同時降低對細胞周期停滯的正常細胞的副作用。
▲p53治療策略：采用MDM2抑制劑減少化療的毒副作用
另一種吸引人的策略是發(fā)現(xiàn)能夠讓p53突變蛋白重新獲得野生型p53的腫瘤抑制活性的藥物。雖然達到這一目標的熱力學要求是一個嚴峻的挑戰(zhàn)，但是蛋白結(jié)構(gòu)研究和電腦模型預測已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個策略在概念上證明這一方法的可行性。其中包括可以讓非結(jié)構(gòu)化突變蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定下來的小分子和多肽。一種名為APR-246的藥物據(jù)稱可以重新激活p53突變蛋白但是具有脫靶效應，該藥物現(xiàn)在正在進行臨床試驗。其它直接穩(wěn)定p53的DNA結(jié)合蛋白域的藥物在臨床前實驗中表現(xiàn)出可喜的前景。被稱為金屬伴侶(metallochaperons)的藥物能夠幫助展開的蛋白(unfolded protein)與鋅離子結(jié)合并且形成一個較為正常的構(gòu)像，從而恢復與DNA結(jié)合的能力。而另一種策略利用了一個意想不到的發(fā)現(xiàn)，那就是有些p53突變蛋白有形成像淀粉樣蛋白一樣的聚合物的傾向，當聚合過程被擾亂后，p53的功能可以得到恢復并且在異種移植模型中觸發(fā)腫瘤萎縮。
▲p53治療策略：靶向p53突變的腫瘤
除了利用藥物恢復突變蛋白中野生型的活性以外，另外一種策略是抑制p53突變蛋白的活性，因為有些腫瘤會依賴于p53突變蛋白的功能。在無法直接抑制p53突變蛋白活性的情況下，仍然可以有方法間接靶向p53突變蛋白促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和存活的機制。
另一種直接攻擊p53突變蛋白的方法是利用它可能成為具有腫瘤特異性的新抗原(neoantigen)的潛力。p53突變蛋白通常表達量很高而且具備抗原特性。而且針對p53突變蛋白的疫苗在小鼠模型中已經(jīng)取得了一定成功?；谶@個想法，多肽疫苗，病毒載體和樹突狀細胞疫苗已經(jīng)進入臨床1/2期試驗。不管基于哪種平臺，免疫療法已經(jīng)能夠引發(fā)針對p53的免疫反應。
理論上逃脫免疫編輯的腫瘤更可能攜帶激發(fā)免疫反應的新抗原。因此將p53免疫療法與增強T細胞反應的免疫檢查點抑制劑結(jié)合起來，可能將針對p53的T細胞轉(zhuǎn)化為抗癌武器。
另一個靶向攜帶p53突變蛋白腫瘤的具有吸引力的策略是利用合成致死概念。很多p53突變蛋白造成的弱點與DDR和新陳代謝相關(guān)。雖然p53缺失的細胞在面對損傷DNA藥物時能夠避免細胞凋亡，但是進一步破壞DDR系統(tǒng)會讓攜帶p53突變的腫瘤對遺傳毒性損傷非常敏感。因此，人們正在開發(fā)將造成DNA損傷的藥物與抑制DDR系統(tǒng)中的ATM, CHK2, ATR和CHK1的抑制劑聯(lián)合使用的策略。雖然加劇基因組不穩(wěn)定性可能達到治療效果，但是一個顧慮是削弱DDR導致的基因突變可能進一步加快腫瘤進化。
通過恢復野生型功能，抑制突變蛋白功能，或者靶向失控的免疫系統(tǒng)，有多種渠道可以靶向癌癥中的p53信號網(wǎng)絡。目前使用這些策略時面對的挑戰(zhàn)表明,進一步理解p53的基本生物學機制對未來臨床應用的成功非常重要。
劃時代的偉大發(fā)現(xiàn):氯硝柳胺成功抑制廣泛性P53缺陷腫瘤
p53基因突變是在各種類型的人類癌癥中最常見的出現(xiàn)的一個。因此，靶向p53缺乏對于大量人類癌癥具有很大的希望。特別是由野生型p53功能喪失所產(chǎn)生的靶向脆弱性可提供靶向廣譜p53突變的手段，包括熱點錯義和無義突變。希望這種方法擴大藥物的治療窗口，使正常細胞受到最小程度的影響。
鑒于臨床中p53突變的大量異質(zhì)性，直接靶向突變型p53蛋白存在相當大的挑戰(zhàn)。另一種方法是利用由野生型p53失去的改變的細胞適應性。在這里，研究團隊通過HTS篩選鑒定氯硝柳胺，用于選擇性殺死p53缺陷細胞的化合物。氯硝柳胺損害p53缺陷細胞和p53突變體患者衍生的卵巢異種移植物的生長。代謝組分析顯示氯硝柳胺誘導線粒體解偶聯(lián)，這使得突變型p53細胞通過花生四烯酸（AA）的優(yōu)先積累而對線粒體依賴性細胞凋亡敏感，并且代表p53突變體腫瘤的一流抑制劑。野生型p53通過促進兩種關(guān)鍵脂質(zhì)氧合基因的轉(zhuǎn)錄誘導來逃避細胞毒性，ALOX5和ALOX12B，催化AA的分解和分解。因此，研究團隊提出了一種新的途徑，通過利用它們對氯硝柳胺誘導的線粒體解偶聯(lián)的易感性來靶向p53途徑缺陷的癌癥。
許多研究聚焦于直接或者間接恢復突變細胞中的p53功能，但是Chit Fang Cheok領(lǐng)導的研究團隊采用了一種不同的策略。他們并沒有嘗試修復突變的p53，因為這個基因在不同的癌癥中突變方式不同，他們通過研究p53缺陷的細胞和正常細胞之間的差別來探索治療p53缺陷的癌細胞的新方法，Cheok稱之為靶向p53的缺失（功能丟失）。
該研究團隊利用攜帶正常p53和突變p53的結(jié)腸癌細胞檢測了1600種FDA批準的藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殺傷p53缺陷的癌細胞（而非p53正常的癌細胞）的能力最強的藥物是氯硝柳胺——一種用于治療絳蟲感染的藥物。隨后的測試表明氯硝柳胺還可以有效殺傷p53突變的其他癌細胞系。
圖片來源：Nature Communications
由于p53控制著廣泛的信號網(wǎng)絡，因此p53功能的缺失可能與細胞中“適應性”的改變有關(guān)，這可能會破壞其基因組穩(wěn)定性和代謝適應性。證據(jù)表明，p53的缺失易患細胞從缺乏PI5P4Kα/β絲氨酸饑餓和ROS誘導的死亡例示消除p53基因突變的細胞的潛在用途合成致死的。然而，盡管在各種代謝途徑中發(fā)現(xiàn)p53的新功能方面取得了進展，但是用于治療益處的這些復雜途徑的藥理學操作仍然具有挑戰(zhàn)性。能夠觸發(fā)最佳保護性p53活化同時在突變細胞中誘導細胞毒性的藥物策略將是治療性翻譯的理想選擇。
氯硝柳胺是自1960年獲得美國食品和藥物管理局（FDA）在腸道絳蟲感染的治療人類使用的口服水楊衍生物。氯硝柳胺是氫離子載體跨越導致線粒體解偶聯(lián)線粒體膜易位質(zhì)子和葡萄糖和脂肪酸氧化的無效循環(huán)。它作為溫和線粒體解偶聯(lián)劑的作用足以殺死駐留在胃腸道中的絳蟲。它在人類出色的安全性（不同于2,4-二硝基苯酚DNP）為瞬態(tài)輕度線粒體解是可容忍在正常細胞中。氯硝柳胺最近的特征在于用于在用途糖尿病，寨卡病毒感染和各種癌癥適應癥，包括成膠質(zhì)細胞瘤的人類腫瘤，結(jié)腸癌和卵巢癌的細胞在體外。報告表明，氯硝柳胺抑制腫瘤生長促進通路，包括WNT /β-連環(huán)蛋白，STAT3，陷波，和mTOR途徑，然而，它的確切抗腫瘤作用機制還不完全清楚。
在這項研究中，研究團隊設(shè)計了一個基于圖像的共培養(yǎng)篩選，以識別對p53缺陷腫瘤細胞合成致死的化合物。我們確定了氯硝柳胺在野生型細胞中同時激活p53促存活功能的同時有效促進缺乏p53功能的細胞凋亡，包括人和小鼠來源。從機制上講，p53活化與脂質(zhì)氧合基因的轉(zhuǎn)錄誘導相結(jié)合，抵消了氯硝柳胺賦予的代謝應激?？傊?，我們的研究揭示了氯硝柳胺靶向的p53缺陷細胞中出乎意料的代謝脆弱性，并支持氯硝柳胺作為針對缺乏p53功能的廣譜腫瘤的一流藥物的潛在用途。
研究團隊對PHARMAKON圖書館的1600種FDA批準的化合物進行了HTS篩查。為了選擇合成殺死p53缺陷腫瘤細胞的化合物，我們開發(fā)了一個強大而靈敏的基于圖像的篩選，使用新生成的HCT116 p53 + / +和p53 - / -表達組蛋白2B（H2B）-GFP和組蛋白的穩(wěn)定細胞系。2B（H2B）-RFP融合蛋白分別（圖 1a）30。在共培養(yǎng)物中篩選細胞系，并使用自動圖像采集和存活的GFP和RFP陽性細胞的定量分析評估每種細胞系對化合物的相對耐受性。
圖。1
圖片來源：Nature Communications
研究結(jié)果提供了明確的證據(jù)，即由于失活點突變或完全喪失p53蛋白而導致的野生型p53功能喪失，使不同物種和組織來源的正常細胞和癌細胞對氯硝柳胺敏感。
氯硝柳胺通過干擾線粒體產(chǎn)能以及引起脂肪酸代謝的改變來影響細胞。實驗顯示線粒體的解偶聯(lián)是氯硝柳胺選擇性殺傷p53突變細胞的基本方式，但是這不足以完全解釋這個現(xiàn)象，因為p53正常的細胞中也出現(xiàn)了相同程度的線粒體解偶聯(lián)。換句話講，在此研究之前科學家們不清楚為什么這種藥物可以更有效殺傷p53突變的細胞。
研究人員檢測了氯硝柳胺治療的細胞的代謝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53突變的細胞中一種叫做花生四烯酸的脂肪酸含量顯著增加。他們的進一步分析發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺引起的線粒體解偶聯(lián)會增加細胞中的鈣離子濃度，從而加速花生四烯酸的產(chǎn)生。該研究團隊發(fā)現(xiàn)p53可以通過開啟兩個可以降解花生四烯酸的基因ALOX5和AOX12B來應對這種變化。而p53突變的細胞中這些基因不會被激活，這使得花生四烯酸持續(xù)富集，從而引起線粒體釋放細胞色素c，導致程序性細胞死亡。未來的工作將進一步尋找其他可以激活相同信號通路以治療p53突變腫瘤的藥物。
“我們將這些信息以一種令人驚訝的方式結(jié)合起來了，這讓我們很興奮?！盋heok說道。為了驗證他們的模型，研究人員敲除了p53正常的細胞中的ALOX5和AOX12B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細胞對氯硝柳胺的敏感性增加，而敲除p53缺陷的細胞中的ALOX5和AOX12B并不會增加這些細胞對氯硝柳胺的敏感性。最后，研究人員確認了氯硝柳胺可以更有效地治療動物身上p53缺陷的腫瘤。他們將培養(yǎng)的細胞注射到小鼠體內(nèi)，經(jīng)過氯硝柳胺治療后監(jiān)控腫瘤的生長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺可以將p53缺陷的腫瘤的生長速度降低一半，而對p53正常的腫瘤無影響。
在這里描述了使用氯硝柳胺作為單一藥劑同時激活p53促生存功能，同時在p53突變體/敲除細胞中產(chǎn)生急性代謝應激和細胞毒性。我們發(fā)現(xiàn)p53通過可逆地激活脂質(zhì)氧合基因ALOX5和ALOX12B來響應急性劑量的氯硝柳胺來控制細胞命運決定（圖 8h）。ALOX5和ALOX12B（花生四烯酸）的底物是氯硝柳胺誘導的代謝應激的核心。野生型p53活性喪失導致花生四烯酸顯著積累，細胞色素c釋放增加，胱天蛋白酶9/3活化和凋亡增加（圖 8h））。重要的是，氯硝柳胺對p53缺陷細胞的選擇性在體內(nèi)腫瘤模型中重現(xiàn)，導致與卵巢患者衍生的異種移植模型中的野生型p53腫瘤相比，對p53突變腫瘤的抗腫瘤發(fā)生作用增加。
我們描述了一種新的p53-ALOX5 / 12B軸，可保護野生型細胞免受氯硝柳胺的侵害。我們的數(shù)據(jù)指出氯硝柳胺作用的新機制依賴于其線粒體解偶聯(lián)活性誘導細胞內(nèi)鈣通量。細胞內(nèi)Ca 2+的增加會觸發(fā)許多酶的活化，包括那些水解磷脂的酶，如磷脂酶A2 50，導致花生四烯酸的釋放（圖 8h））。顯然，我們發(fā)現(xiàn)鈣螯合劑或細胞內(nèi)鈣釋放抑制劑以及細胞溶質(zhì)PLA2抑制劑減弱了氯硝柳胺的作用。與此一致，代謝組分析揭示了磷脂組分的增加，即LysoPE和LysoPC，其在磷脂酶A2水解磷脂的sn-2?；I時除了花生四烯酸外還釋放。該途徑通過多種酶的作用提供前體，用于產(chǎn)生白三烯，血栓素和前列腺素等，隨后代謝花生四烯酸35。我們的數(shù)據(jù)表明，p53缺陷細胞中其他AA代謝酶的存在顯然不足以阻止細胞內(nèi)AA的災難性積累。然而，在野生型細胞中，ALOX5和ALOX12B基因的顯著藥物誘導的p53依賴性轉(zhuǎn)錄激活阻止了AA的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換率的不平衡。通過敲低實驗，我們剖析了將p53活化與氯硝柳胺敏感性聯(lián)系起來的關(guān)鍵成分，并鑒定出ALOX5和ALOX12B是氯硝柳胺反應的重要調(diào)節(jié)劑?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)將p53-ALOX5 / 12B軸置于氯硝柳胺處理后調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)和促存活功能的核心。
雖然最近的報道暗示氯硝柳胺通過抑制Wnt，Notch，mTOR和STAT3途徑抑制腫瘤生長，但其確切的抗腫瘤機制尚不清楚。在這里，我們首次將p53鑒定為氯硝柳胺反應的關(guān)鍵決定因素，并證明即使在HCT116的Wnt /β-連環(huán)蛋白突變體背景中，p53基因的敲除也顯著增加細胞凋亡。在Wnt /β-連環(huán)蛋白突變體背景中p53敲除增加的氯硝柳胺敏感性不是因為p53缺失以某種方式改變Wnt信號傳導途徑并增強Wnt靶向藥物的作用，因為Wnt抑制劑不會引起p53缺陷細胞的任何優(yōu)先死亡（補充圖 3f）。相反，這意味著p53調(diào)節(jié)獨立于Wnt途徑的另一種機制，至少在這種情況下，調(diào)節(jié)細胞對氯硝柳胺的反應。在這里我們意外地揭示了氯硝柳胺誘導的線粒體解偶聯(lián)影響正常的磷脂生物發(fā)生并通過p53途徑激活穩(wěn)態(tài)反應機制。
關(guān)于p53突變腫瘤的潛在治療的最激動人心的觀察結(jié)果是氯硝柳胺比野生型腫瘤更有效地回歸p53突變體腫瘤，如本文使用人卵巢PDX小鼠模型和同基因細胞系異種移植模型所證明的。刪除HCT116 p53 中的p53基因- / -使得腫瘤異種移植物對氯硝柳胺處理顯著更敏感（圖 8a，b），并且我們建立的卵巢PDX模型中的p53突變也是如此。與野生型細胞相比，氯硝柳胺對攜帶不同p53點突變（p53R175H）或p53基因位點（p53 - / -）基因敲除的MEF的效力顯著增加（圖。 2b，d）。此外，由于這種治療方法針對功能喪失的野生型p53而不是特定的p53點突變或缺陷，這種方法可能對包含p53途徑缺陷的廣譜腫瘤有效，包括滅活點p53的突變和缺失基因，并在體內(nèi)耐受良好。實際上，我們的動物研究還表明，氯硝柳胺具有良好的耐受性，并且在口服給藥過程中沒有報道對小鼠體重和生理的不良影響。這與基于細胞的研究一致，顯示正常細胞對氯硝柳胺的良好耐受性和未轉(zhuǎn)化背景中p53的喪失，對氯硝柳胺敏感性產(chǎn)生實質(zhì)性影響?？傊?，結(jié)果表明氯硝柳胺誘導通過p53介導的促存活機制，可通過同時激活p53和在損失驅(qū)動的腫瘤中誘導花生四烯酸/細胞色素c凋亡反應來利用腫瘤特異性靶向。 p53
重要的是，p53-ALOX5 / ALOX12B途徑組分的表達可用于腫瘤分層和直接氯硝柳胺治療可能有反應的那些。我們利用大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學的進步，允許對廣泛的腫瘤數(shù)據(jù)集進行詢問，以識別和驗證新的基因 - 基因關(guān)系，并提供相應區(qū)分癌癥群的方法。TCGA RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)顯示ALOX5和ALOX12B基因表達與野生型p53基因特征48之間存在顯著相關(guān)性（圖 6h和補充圖 6 h -n））。這提供了一個令人信服的建議，即除了p53基因標記外，ALOX5和ALOX12B的加入將提供臨床注釋的基因標記，可以潛在地用作氯硝柳胺反應的預測因子。
此外，其他平行機制，如p53基因的雜合性缺失伴隨著17p13.1的缺失，已知會驅(qū)動侵襲性腫瘤表型，可能會因偶然缺失ALOX12 / 15而促進花生四烯酸積累?；?/span>51并為氯硝柳胺治療這一類侵襲性人類腫瘤提供了另一種治療機會。
該研究提供了直接證據(jù)，即p53的缺失/突變和脂質(zhì)氧合基因的受損表達賦予對氯硝柳胺的改善的治療反應。我們?yōu)橐郧拔粗穆认趿纷饔脵C制提供了新的見解，并突出了使用氯硝柳胺對抗p53突變的抗癌治療的新的令人興奮的治療機會。
基于他們的發(fā)現(xiàn)，研究人員已經(jīng)為這項研究申請了專利，由于這種藥物是靶向p53缺陷，而非靶向特殊的基因突變，因此它將適用于更大范圍的p53突變的腫瘤。氯硝柳胺已經(jīng)在人體身上使用了數(shù)十年，被WHO列為一種有效、安全而便宜的藥物，這使得它成為一種可能治療一系列p53缺陷腫瘤的救命良藥。
2017年12月7日一支跨國科研團隊在《Nature》發(fā)表最新研究結(jié)果：用于治療酗酒的藥物雙硫侖，被確認具有抗癌作用。研究指出，雙硫侖通過阻止細胞處理廢棄蛋白，能夠殺死癌細胞。這是首次明確了雙硫侖的抗癌機理，解決了半個世紀以來困擾著癌癥研究的難題。2018年01月18日中華人民共和國科學技術(shù)部官網(wǎng)上也發(fā)表了戒酒藥物“雙硫侖”被發(fā)現(xiàn)具有抗癌特性的文章。
來自丹麥、捷克和美國的研究團隊通過梳理丹麥癌癥登記系統(tǒng)，對丹麥2000年至2013年間診斷出的24萬多例癌癥患者的數(shù)據(jù)進行分析，包括抗癌效果，以及每位患者服用藥物的數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服用雙硫侖的3000多名患者，比停止服用雙硫侖的1177名患者相比，死亡率低了34%。它治療前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和其他癌癥均有效。
在《Nature》的這篇文章中也提出了一個雙硫侖抗癌的機制：真正有活性的分子，是雙硫侖的代謝產(chǎn)物CuET，CuET會促進NPL4蛋白凝結(jié)并與一個叫 p97（又名VCP）的蛋白結(jié)合，影響了p97在癌細胞里降解蛋白的功能，最后的結(jié)果就是誘發(fā)癌細胞死亡。簡言之，雙硫侖通過阻止細胞處理廢棄蛋白，實現(xiàn)消滅癌細胞的目的。讓人震驚的是，這種雙硫侖對腫瘤組織還存在“天然靶向性”。
雙硫侖是什么？一種普通廉價的戒酒藥？怎么發(fā)現(xiàn)的？
下面要說的這個卻是實實在是在《科學》雜志報道的一個案例。
在上個世紀70年代，一名腫瘤醫(yī)生報告了一位“奇怪”的病例。一位38歲的乳腺癌伴隨骨轉(zhuǎn)移患者，在確診后，由于極度悲傷過度變成了重度酗酒者。醫(yī)生為了讓她好好的度過余下時光，停止了所有治療，選擇給她開了戒酒藥。
然而，讓醫(yī)生倍感意外的是，這位患者在家該吃吃改喝喝，一直活了近10年，最后還是因為醉酒摔死的。不僅如此，更讓醫(yī)生感到意外的是尸檢還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到她骨骼中的腫瘤組織也沒了。難道真的是喝酒把這位患者的癌癥給喝沒了？
亦或是這種戒酒藥，雙硫侖意外的發(fā)揮了重要作用。
就在2017年12月7日，全球頂級科學期刊《自然》雜志上發(fā)表了一項超級重磅的研究。來自丹麥、美國、捷克三個國家的研究人員合作，通過對丹麥24萬例癌癥患者的醫(yī)療數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，長期持續(xù)服用雙硫侖的癌癥患者，相比于沒有使用雙硫侖的患者，死亡率降低了34%。
相比其它一些研究缺乏人體的抗癌臨床研究數(shù)據(jù)。這篇Nature 的起點就是這個人體的臨床研究數(shù)據(jù)。大家看下面這個表格，作者告訴了我們那些之前接受過雙硫侖戒酒治療的病人癌癥死亡率低于未服用雙硫侖的病人。這也就是“戒酒藥物能抗癌”的臨床試驗依據(jù)。
圖片來源：Nature
不僅如此，他們還首次確定了戒酒硫抑制癌癥的具體機制，并在多種癌癥模型中證明了其抗癌活性。更重要的是，這種廣譜抗癌藥對腫瘤組織還存在“天然靶向性”。
本研究領(lǐng)導者之一Jiri Bartek教授（右）
其實上述病例報告早就引起了科學工作者極大的興趣，并進行了大量的臨床試驗。1993年，一項包含64名非轉(zhuǎn)移性高危乳腺癌患者的臨床二期試驗表明，相比于單獨化療，雙硫侖聯(lián)合化療可以使乳腺切除患者在五年隨訪期內(nèi)癌癥復發(fā)率降低54%，死亡率降低近30%。
同樣的，2015年一項包含42名IV期非小細胞肺癌患者的臨床二期試驗表明，相比于單獨化療，雙硫侖聯(lián)合化療可以使患者的生存期延長41%。同時，服用雙硫侖的晚期肺癌患者中，有兩名患者在為期3年的隨訪結(jié)束后仍舊存活，而安慰劑組則沒有一人活過兩年。
然而，由于大型制藥公司基本不會為了這種沒有專利保護的藥物進行三期臨床試驗。更重要的是，這一藥物的抗癌機制此前也尚不明確。因此，一直到現(xiàn)在都很少有醫(yī)生敢給患者開這種“不權(quán)威”的抗癌藥。
為了打破這一僵局，進一步大規(guī)模證明雙硫侖的抗癌活性，研究人員選擇對丹麥2000-2013年間新診斷的24萬例癌癥患者的健康數(shù)據(jù)以及服藥數(shù)據(jù)進行了系統(tǒng)的分析，結(jié)果卻讓研究人員感到“氣憤不已”。
他們發(fā)現(xiàn)，相比于在確診患癌癥后因為惜命戒酒而停止使用雙硫侖的患者來說，那些確診后不愛惜生命，仍舊大量酗酒并接受雙硫侖治療的癌癥患者，其存活時間反而延長了34%。
酒精與癌癥
鑒于雙硫侖的良好效果，斯德哥爾摩卡羅林斯卡學院（Karolinska Institute）的癌癥生物學家Thomas Helleday教授表示，“由于在臨床上已經(jīng)使用了近百年，雙硫侖的安全性是毋庸置疑的。雖然大公司可能對沒有專利保護的雙硫侖不感興趣，但是鑒于臨床試驗的良好效果，腫瘤醫(yī)生的確可以考慮將雙硫侖作為一種廉價的癌癥治療藥物?！?/span>
那么這種古老的戒酒藥是如何發(fā)揮抗癌活性的呢？
這就涉及到細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)平衡了，正常情況下，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成并不是完美無瑕的，一部分蛋白質(zhì)在合成過程中可能會出現(xiàn)錯誤，或者是其空間三維結(jié)構(gòu)不正確。而這些不正常的蛋白質(zhì)的積累最終就會誘導細胞死亡。
這時候就需要細胞內(nèi)的泛素蛋白酶系統(tǒng)，p97-NPL4通路出馬了。這一通路主要負責細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的“質(zhì)量控制”，一旦發(fā)現(xiàn)“殘次品”，就會主動降解掉這些無用蛋白。尤其是在癌細胞內(nèi)，由于細胞周期加快，蛋白質(zhì)的合成速度也非?？?，產(chǎn)生的“殘次品”也越多。因此，癌細胞的生長和存活更加依賴P97-NPL4通路來進行蛋白質(zhì)的“質(zhì)量控制”。此前的研究也表明， p97通路的顯著激活，與多種癌癥的生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
蛋白質(zhì)需要正常的結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮功能，圖為DNA解旋酶
說到這里，大家或許已經(jīng)猜到了雙硫侖抗腫瘤的機制了。沒錯，來自丹麥的Jiri Bartek教授領(lǐng)導的研究小組發(fā)現(xiàn)，雙硫侖在機體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會與銅離子結(jié)合形成有活性的抗癌復合物，這種復合物可以與p97-NPL4通路中的NPL4蛋白牢固結(jié)合，抑制其“質(zhì)量控制”功能，使癌細胞內(nèi)積累大量的殘次蛋白，最終誘導癌細胞的凋亡。
同時，在此次試驗中，Bartek教授也順便驗證了雙硫侖的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)雙硫侖的確可以顯著抑制乳腺癌以及黑色素瘤細胞在小鼠體內(nèi)的生長，大大延長了小鼠的生存期。
雙硫侖（紫紅色）顯著延長了黑色素瘤小鼠的壽命
這個來自于病人的研究結(jié)果閃耀著萬丈光芒，瞬間秒掉那些來自老鼠、兔子、猴的研究結(jié)果。其實呢，雙硫侖在動物水平的抗癌作用是有一些報道的，并且前人的研究還告訴我們這種抗癌作用和銅離子相關(guān)。這篇文章的作者自然不會放過這些線索，他們在小鼠身上再次驗證了雙硫侖結(jié)合含銅飲食（葡萄糖酸銅）的抗腫瘤作用。如果說這是對前人研究的重復，那么這個實驗出現(xiàn)了另一個亮點。作者根據(jù)文獻猜測雙硫侖在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和銅生成的配合物（CuET）能發(fā)揮抗癌活性。
圖片來源：Nature
為驗證這一猜測，作者檢測了動物腫瘤組織和正常組織中CuET的含量差異。逆天的結(jié)果是，腫瘤組織的CuET遠高于肝、腦等非腫瘤組織。
圖片來源：Nature
要知道實現(xiàn)抗癌藥物的腫瘤組織靶向性可是個世界性難題。雖然原文作者也坦言不知道為什么CuET有這樣的作用，但是人家就是發(fā)現(xiàn)了這個現(xiàn)象。這人品，不服不行啊。接下來作者大量合成了CuET開始直接評價其對腫瘤細胞以及腫瘤動物模型的藥理作用。很明顯，研究進行到這可以說CuET從幕后走上臺前。
雖然后面的研究全部圍繞著CuET展開，但是作者偶爾也還要把前人對雙硫侖的研究成果搬出來指導CuET的機制研究。比如，作者說雙硫侖能夠通過抑制細胞蛋白降解發(fā)揮抗腫瘤作用，那么CuET是不是也有類似的機制呢。于是，他們評價了CuET在這方面的性質(zhì)。結(jié)果表明，CuET能夠抑制p97 segregase依賴的蛋白降解。
圖片來源：Nature
在發(fā)現(xiàn)CuET對p97 segregase的作用后，作者還要找到這種作用的直接靶點。那么自然要考察和p97 segregase相關(guān)的蛋白NPL4和UFD1。通過ITC和DARTS兩種手段，作者證明了NPL4是CuET的直接結(jié)合靶點。至于ITC和DARTS是什么，我們平臺以前的文章都是畫過重點的哦，這次就不羅嗦啦（想看的可以點擊這里和這里）。之前有研究表明，p97-UFD1-NPL4復合物在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)以及細胞有絲分裂紡錘體去組裝過程中都可能起到一定作用（PNAS, 2006, 104, 467-472），前者是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，而后者是細胞增殖的關(guān)鍵步驟。CuET結(jié)合NPL4而抗癌，很可能與這些過程有關(guān)。
圖片來源：Nature
證明完CuET的直接作用靶點還不算完，作者又用實驗數(shù)據(jù)告訴我們NPL4的聚集觸發(fā)了熱休克應答（這一過程自然和腫瘤密不可分），而CuET對這一過程依然有著很好的調(diào)控作用。
圖片來源：Nature
那么有人可能又會問了，正常細胞內(nèi)也需要p97的“質(zhì)量控制”功能啊，使用大劑量雙硫侖抗癌會不會引發(fā)嚴重副作用呢？
在小鼠試驗中，Bartek教授還發(fā)現(xiàn)，雖然正常細胞的蛋白質(zhì)“質(zhì)量控制“也必須要p97蛋白的參與，但是在給小鼠喂食雙硫侖和銅離子后，雙硫侖的代謝產(chǎn)物對腫瘤組織具有“天然靶向性”。表現(xiàn)為，這種代謝產(chǎn)物主要集中在腫瘤組織。相比于外周正常組織以及血液，腫瘤組織中的濃度要高出10倍。然而遺憾的是，Bartek教授并沒有發(fā)現(xiàn)其中的原因。
總而言之，這一發(fā)現(xiàn)，確定“百年老藥“雙硫侖抗癌活性的具體機制，也為雙硫侖的臨床應用奠定了基礎(chǔ)。目前，研究人員正在籌劃進行三個臨床試驗，包括使用雙硫侖聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌，結(jié)腸癌以及膠質(zhì)母細胞瘤。Bartek教授也表示，“這一藥物將有望拯救全球無數(shù)癌癥患者的生命。
從學術(shù)研究的角度上講，這篇文章從雙硫侖人體試驗結(jié)果一直到最終的CuET直接作用靶點與相關(guān)機制研究，揭開了雙硫侖抗癌作用的層層面紗。研究文章的后半部分對于CuET抗腫瘤作用，直接結(jié)合靶點以及相關(guān)作用機制研究并沒有給人技驚四座的感覺。文章前半部分的人體試驗和CuET的腫瘤組織選擇性才是讓人拍案叫絕的重大發(fā)現(xiàn)。研究者巧妙地分析了許多前人研究雙硫侖抗癌的結(jié)果，大膽假設(shè)，仔細求證，最終找到了CuET。
大膽假設(shè)：氯硝柳胺+雙硫侖+化療聯(lián)合靶向P53/P97缺陷治療一系列P53/P97突變腫瘤
假設(shè)基礎(chǔ)和意義
1、P53基因是人體一個重要的抗癌基因（tumor suppressor gene），其野生型使癌細胞凋亡，從而防止癌變。P53還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。由于超過一半的癌癥病人腫瘤中的抑癌基因p53存在突變，這使得p53成為了一個極具吸引力的抗癌靶點。
2、是P97（VCP），又叫含纈酪肽蛋白（ Valosin-containingprotein）是一種在生物體內(nèi)高度豐富的蛋白質(zhì)，廣泛存在的膜結(jié)合糖蛋白,在細胞活性中有著廣泛的功能,作為類似分子伴侶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解及細胞周期調(diào)控中起重要作用。在這些細胞過程中,p97與其輔因子UFD1-NPL4結(jié)合,把多泛素化錯誤折疊的蛋白通過蛋白酶進行降解。新近研究發(fā)現(xiàn),p97能夠獨立于UFD1-NPL4,參與細胞質(zhì)內(nèi)運輸和自噬。通過溶酶體能夠使蛋白降解，p97在細胞自噬中具有十分重要的作用。抑制P97缺陷可以增強細胞自噬功能，可以自噬癌細胞。
3、氯硝柳胺和雙硫侖都是經(jīng)過各國藥品監(jiān)管機構(gòu)批準上市超過50年以上的臨床用藥品，其安全性都已經(jīng)過長期驗證。
4、以上2種藥品都是十分廉價的產(chǎn)品，可以是全球平民不再被昂貴的癌癥藥品所困，可以獲得健康權(quán)力。
5、可以極大減少各國醫(yī)療健康支出，節(jié)省資源。
6、強烈建議政府衛(wèi)生主管部門和臨床研究機構(gòu)開展臨床研究，使其成為癌癥治療的重要方法。
參考資料：
1.Mitochondrial uncoupling reveals a novel therapeutic opportunity for p53-defective cancers
Published26 September 2018
Nature Communications volume 9, Article number: 3931 (2018)
DOI https://doi.org/10.1038/s41467-018-05805-1
https://www.nature.com/articles/s41467-018-05805-1
2.https://www.nature.com/articles/nature25016
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