作者：葉子
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在今年國自然面上項目的資助中，循環(huán)系統(tǒng)資助了286項，資助金額為1.56億元。這些年，關于心肌細胞/血管細胞損傷、修復、重構和再生（H0203）的研究最多，其次是動脈粥樣硬化、冠心病、心律失常、心力衰竭和高血壓等領域。這其中一大熱門研究領域就是ncRNA，在循環(huán)系統(tǒng)中miRNA、lncRNA、circRNA都很常見。
越來越多的證據(jù)表明，ncRNA在心血管病理生理學中起著重要的作用。另外，健康者與患者體內ncRNA釋放到外周血中的濃度是不同的。雖然外周血中ncRNAs的來源與功能研究甚少，但這些ncRNAs分子可以作為非侵襲性且容易獲得的有關風險分級、診斷及預后的標志物。
這里面miRNA有點老，評審也已經看疲了，circRNA又太新，相關研究工具還不多，做起來吃力。只有lncRNA既能找到創(chuàng)新點，又有大量成熟的工具可以用，完美。那么，在寫標書的時候，可以怎么來設計lncRNA的研究線路呢？在今年的循環(huán)系統(tǒng)面上項目中，lncRNA的相關項目有20項。
· LncRNA（AK050954）調控心肌纖維化的作用及機制研究
· LncRNAH19啟動子區(qū)域DNA甲基化調控VSMCs 表型轉化及其在動脈鈣化中的作用機制
· 心肌細胞lncRNA-056298調控GAP43影響心臟內在自主神經重構在神經叢消融犬房顫再誘發(fā)中的作用及機制
· lncRNA MEG3與miR-7的交叉對話在深低溫低流量后腦缺血再灌注損傷中的作用
· 長鏈非編碼RNA-MEG3通過miR-21/HDACs通路調控血管平滑肌細胞生長周期及靜脈移植物內膜增生的分子機制研究
這些課題從研究機制來看可以分成4個維度。
lncRNA研究的4個層面
lncRNA在染色質層面調控基因表達
在研究lncRNA功能時，首先肯定要看lncRNA的細胞定位，如果是定位于細胞核，就要考慮到其在染色質層面起調控作用。可以從以下步驟來進行分析：
（1）lncRNA是否能與染色質結合；
（2）染色質狀態(tài)是否受lncRNA影響；
（3）具體的調控區(qū)域是什么；
（4）lncRNA結合蛋白鑒定；
（5）靶基因表達是否受lncRNA影響。
lncRNA基因組調控機制
在這個層面的研究是根據(jù)lncRNA在基因組上的位置。很多l(xiāng)ncRNA周圍會有mRNA存在，而這類lncRNA就會調控附近mRNA的表達。這時，首先就要確認lncRNA與cis靶基因之間是否有表達相關性。把lncRNA干預表達后，mRNA表達是否受影響。后續(xù)的研究也需要關注該lncRNA是否會招募一些蛋白或復合體，再去結合到mRNA的啟動子區(qū)去實現(xiàn)調控功能。
但如果lncRNA附近沒有功能基因表達的改變，可以考慮trans靶基因調控。先通過實驗去篩選和該lncRNA可能結合的蛋白，或者通過trans靶基因預測，來尋找可能下游靶向mRNA。再分析lncRNA和靶基因的表達相關性。后期證明該lncRNA和結合蛋白是否真的是結合到靶基因啟動子區(qū)是實現(xiàn)mRNA的表達調控。
兩方面的調節(jié)機制均涉及RNA-蛋白質的相互作用。在沒有目的蛋白的時候，此時不得不使用一些先進技術來檢測RNA-蛋白質相互作用。
lncRNA調控ceRNA
ceRNA調控機制是lncRNA在細胞質中起轉錄后調控的重要方式之一?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以作為miRNA的“sponge”，競爭性地結合miRNA，進而影響miRNA對下游靶基因的調控。
因此，這種調控機制的一個最核心的前提就是，lncRNA和某一個mRNA擁有共同的結合miRNA。有了這個基礎后，用實驗去證明這三者之間的調控關系就可以了。轉錄后調節(jié)相對簡單，大家在選擇lncRNA的時候，也可以對其序列做一下分析，看看自己研究的lncRNA是作為miRNA的sources還是sinks？
lncRNA調控mRNA穩(wěn)定性
有一類特殊lncRNA是由mRNA的antisense轉錄而來，而這種lncRNA對同源mRNA很有可能有調控作用，特別是轉錄后mRNA的穩(wěn)定性。在這種情況下，首先得確認該lncRNA與mRNA之間的關系，然后去檢測他們之間的表達相關性，最后去探究該lncRNA對mRNA轉錄表達和蛋白表達的影響。
lncRNA研究中的常見問題
1. 使用包含lncRNA和miRNA的芯片是否合適？
答：一張芯片上同時包含miRNA和lncRNA，甚至還包含mRNA及SNP等多種類型探針的芯片，被稱為嵌合芯片。這類芯片通常情況下，檢測的范圍很廣，但是檢測的重復性并不能讓人滿意。至于是否要采用嵌合芯片，取決于實驗目的。但是相對而言，同時檢測lncRNA和mRNA是常見的，但是同時檢測lncRNA和miRNA非常地少見。
2.lncRNA的siRNA靶點預測怎么選？
答：針對lncRNA的siRNA靶點預測，目前還沒有特別有效的工具。只能靠運氣和人品進行。相對省錢的方法是，先化學合成siRNA進行篩選，有效的siRNA再進行病毒包裝。
3.做篩選需要選用多少對樣本？
答：理論上，三對樣本就足夠（一對樣本指同一個病人的癌組織和癌旁組織）。但是為了篩選效果的可靠性和可重復性，建議最好6對樣本或以上。當然，如果是土豪，那么the more the better.
4.樣本如何保存？
答：用于RNA研究的樣本保存，最重要的是兩點：1）快速；2）低溫。有種方法是，學生拿著液氮罐等在主刀醫(yī)生旁。一旦獲得樣本，立即放入液氮罐以防止降解。
5.最后，再推薦一篇循環(huán)系統(tǒng)lncRNA的研究范文給大家：
Long Noncoding RNA Malat1 Regulates Cerebrovascular Pathologies in Ischemic Stroke
http://circres.ahajournals.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=24602777
這里面主要介紹了lncRNA在內皮細胞中的作用，而內皮細胞控制心血管系統(tǒng)的關鍵功能。以及作者如何用人內皮細胞進行下一代測序實驗以鑒定存在于內皮細胞中的lncRNA，對于循環(huán)系統(tǒng)方面的lncRNA研究可以起指導作用。
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