第二步
反轉(zhuǎn)錄cDNA合成
反轉(zhuǎn)錄cDNA比較簡單, 將抽提好的RNA稀釋終濃度為1ug/ul。提前將以下試劑在冰上融化，所有酶都要最后從冰箱取出,加入體系。
本步驟在普通PCR管中進(jìn)行即可 ，Mix配制
一步法：
cDNA可保存-80℃?zhèn)溆茫荒暧行? 稀釋10-30倍。
第三步
熒光定量RT-PCR
一般來講,進(jìn)行Real-time qPCR Master Mix都是 2×濃縮液,只需要加入模板和引物。由于Real-time qPCR靈敏度高,所以每個樣品至少要做3個平行孔, 以防在后面的數(shù)據(jù)分析中, 由于Ct相差較多或者SD太大,無法進(jìn)行統(tǒng)計分析。
Real-time qPCR靈敏度非常高, 反應(yīng)體系的引物終濃度為200-500 μM; 模板總RNA一般是10 ng-500 ng；如果cDNA，通常情況下是1 ul 的10-30倍稀釋液, 要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗值，在操作過程中,還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中下面幾點需要注意:
1. Master Mix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。
2. 配制Mix減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭! 不要連續(xù)用同一個槍頭加樣，不沾的槍頭可以反復(fù)打。
4. 所有成分加完后, 離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔，多配置mix可以配置4孔量。
RT-PCR儀器要提前預(yù)約，約2-3h。
CD/DVD拷貝數(shù)據(jù)
熒光定量PCR中的陰性對照是以不表達(dá)的基因為模板，雜峰出現(xiàn)；陽性對照是以確定表達(dá)的基因為模板，融解曲線為單一峰；無模板對照就是加水代替模板，無峰出現(xiàn)；污染對照是兩種基因的表達(dá)，出現(xiàn)雙峰。
01
新建一個程序（如果已有的話可以直接用）。
File----new-----默認(rèn)OK
02
尋找基因的名稱（沒有的話可以自己添加）。
Setup——add detector——find（基因名）
03
分別標(biāo)出樣品和基因名稱所在的行列（可以不標(biāo)如果自己知道的話）。
左鍵選中——點擊基因名稱
左鍵選中——sample name
如果不選中導(dǎo)出都是空數(shù)據(jù).
04
添加溶解曲線（反應(yīng)溫度時間默認(rèn)即可），
Thermal cycle——stage4——Add dissolution stage
推薦：60 ?C- 1min后可以加72 ?C-30s
95?C-1 min, 40 cycles of 95?C-12 sec; 60?C-5 sec; 72?C-30 sec and then a dissociation curve step
05
體積10ul
06
連接儀器，放入樣品
Instrument——real time——connect儀器——open——close
2h
07
保存文件到自己的文件夾中
08
程序完成后，點擊分析，然后保存，會生成.SDS文件，點擊Export，導(dǎo)出TXT文件。
09
在文件夾中選中所要刻錄的文件，右鍵點擊刻錄選中即可。
10
TXT文件中的CT值分析即可（15-30為佳）。
第四步
數(shù)據(jù)分析公式
相對定量分析F=2-??Ct
ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；
-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；
2-ΔΔCt反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達(dá)水平
例如GAPDH為內(nèi)參，檢測RPS15A基因
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