豆粕是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的一種優(yōu)質(zhì)蛋白源。但其中含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，目前對(duì)這些抗?fàn)I養(yǎng)因子去除的研究較多，而對(duì)豆粕中更易被動(dòng)物吸收的小肽的研究卻不多見(jiàn)。
在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)上一般認(rèn)為“含2或3個(gè)氨基酸殘基的肽為小肽”。現(xiàn)代研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)的消化終產(chǎn)物的大部分往往的小肽而不是氨基酸。小肽能完成的通過(guò)腸粘膜細(xì)胞而進(jìn)入體循環(huán)，它的吸收具有運(yùn)轉(zhuǎn)速度快、耗能低、載體不易飽和等優(yōu)點(diǎn)，且各種肽之間運(yùn)轉(zhuǎn)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性與抑制性。小肽也是組成內(nèi)氨基酸的重要來(lái)源之一，動(dòng)物可以直接利用小肽中的氨基酸合成組織蛋白。小肽飼料就是通過(guò)化學(xué)或生物方法將本來(lái)不適合動(dòng)物利用的蛋白原料分解，制成的含有大量小肽的飼料產(chǎn)品。生產(chǎn)小肽飼料的方法主要有酸解法、酶解法、微生物發(fā)酵法。酸解法通過(guò)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的作用分解大分子蛋白為小分子肽，由于強(qiáng)酸強(qiáng)堿具有腐蝕性，該法會(huì)帶來(lái)大量的污染；酶解法通過(guò)酶的定向分解的特性將大分子蛋白分解為小分子肽；微生物發(fā)酵法是利用微生物的生化反應(yīng)將蛋白轉(zhuǎn)化為肽。
本文是選用普通豆粕，采用枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳酸菌多菌種固態(tài)發(fā)酵，研究微生物發(fā)酵對(duì)豆粕中小肽含量的影響，以期獲得高小肽含量的發(fā)酵產(chǎn)品。
1材料與方法
1.1菌種
為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏的植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和酵母菌。
1.2原料
豆粕：市售，水分含量12.3%，粗蛋白含量40.25%，小肽含量（干基）1.61%。
1.3培養(yǎng)基
乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，溫度30度，121度滅菌15分鐘。
枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCL5g，PH7.2，蒸餾水1000ml，溫度35度，121度滅菌15分鐘。
酵母菌：酵母浸提物5g，蛋白胨10g，NaCL5g，水1000ml，PH自然，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，溫度32度，121度滅菌15分鐘。
1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備
凱氏定氮儀、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、PH酸度計(jì)、水浴鍋、微量移液器等。
1.5菌株及發(fā)酵種子液的制備
分別從保存的各菌種斜面接1環(huán)到各菌種增殖培養(yǎng)基。植物乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基，38度靜置培養(yǎng)48小時(shí)，枯草芽孢桿菌與蠟樣煙包桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別在30度、120r/min振蕩培養(yǎng)和30度靜置培養(yǎng)48小時(shí)。
從上述擴(kuò)大培養(yǎng)好的菌液中，以2%的接種量分別接到各菌的發(fā)酵種子培養(yǎng)液中（培養(yǎng)基成分同各菌增殖培養(yǎng)基），培養(yǎng)24小時(shí)，制成發(fā)酵種子液。
1.6小肽測(cè)定方法
酸溶蛋白含量（三氯乙酸法）減去游離態(tài)氨基氮含量。
1.7試驗(yàn)設(shè)計(jì)
以發(fā)酵飼料的小肽含量作評(píng)定指標(biāo)。
1.7.1菌株組合
枯草芽孢桿菌-蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌-酵母菌、枯草芽孢桿菌-植物乳酸菌、蠟樣芽孢桿菌-酵母菌、蠟樣芽孢桿菌-植物乳酸菌、酵母菌-植物乳酸菌。
1.7.2發(fā)酵條件優(yōu)化
稱取一定量的豆粕裝入500ml三角瓶中，調(diào)整其含水率，原料豆粕不滅菌，培養(yǎng)基的PH為自然，發(fā)酵時(shí)間固定為24小時(shí)。通過(guò)6組4因素、3水平的正交試驗(yàn)對(duì)起始溫度、接種量、通氣量、料水比等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。其他因素水平表如表1.
2結(jié)果與討論
2.1二元混菌發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）
通過(guò)表2可以得知，枯草芽孢桿菌-蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌-酵母菌、枯草芽孢桿菌-植物乳酸菌、蠟樣芽孢桿菌-酵母菌、蠟樣芽孢桿菌-植物乳酸菌、酵母菌-植物乳酸菌處理組中小肽含量最高的分別是8.12%、9.82%、13.32%、12.70%、10.39%和11.62%。小肽含量的最高組合是枯草芽孢桿菌-植物乳酸菌。不同的菌種組合其最優(yōu)的發(fā)酵條件有很大的差別。
通過(guò)極差分析，由表3可知，不同的菌種組合其混菌發(fā)酵的較優(yōu)水平也不相同，但溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響在這6組中都表現(xiàn)出一致性，即溫度達(dá)到40是最好；其次是通氣量對(duì)發(fā)酵效果的影響也同樣表現(xiàn)出一致性，除了蠟樣芽孢桿菌-酵母菌外其他5組通氣量達(dá)60g/500ml時(shí)最好。另外，由極差分析可知，在混菌發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)小肽總含量影響最大的是發(fā)酵溫度，而接種量對(duì)小肽總含量的影響反而最小，這又可能是不同的菌株間也存在著互相競(jìng)爭(zhēng)。
2.2最優(yōu)發(fā)酵條件
通過(guò)最優(yōu)水平表可知，發(fā)酵溫度對(duì)小肽總含量的影響表現(xiàn)的極為一致，即溫度達(dá)到40度時(shí)最好。在枯草芽孢桿菌-蠟樣芽孢桿菌組中，雖然4%的接種量是最好的，但2%的接種量和4%的接種量沒(méi)有明顯的差別，從減少生產(chǎn)成本上來(lái)說(shuō)，選擇2%的接種量。在生產(chǎn)中通氣量越大越能節(jié)省成本。在枯草芽孢桿菌-蠟樣芽孢桿菌組合蠟樣芽孢桿菌-酵母菌組中，最優(yōu)的水平分別是60g/500ml和45g/500ml，但都和75g/500ml沒(méi)有明顯差別；所以在生產(chǎn)中，都選用75g/500ml。固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響極大，基質(zhì)中水分的多少影響到基質(zhì)的疏松程度以及無(wú)機(jī)鹽含量，同時(shí)也會(huì)影響到基質(zhì)中含氧量的多少。高含水量導(dǎo)致多孔性降低，氧擴(kuò)散受限制，對(duì)厭氣性細(xì)菌是合適的，對(duì)好氧菌不利且會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。所以水分含量盡量不要太高。在本試驗(yàn)中料水比都在1:1以上，對(duì)小肽的總含量增加比較好。但在蠟樣芽孢桿菌-酵母菌組和蠟樣芽孢桿菌-植物乳酸菌組中，最優(yōu)水平分別是1:1和1:1.2，但都和1:0.8,沒(méi)有顯著影響，故采用1:0.8合適。
2.3驗(yàn)證試驗(yàn)
驗(yàn)證試驗(yàn)的各個(gè)菌種組合的發(fā)酵條件及結(jié)果見(jiàn)表5.
由表5可以看出，改進(jìn)后的發(fā)酵條件更適合工業(yè)生產(chǎn)，且其小肽總含量也沒(méi)有明顯的下降。最好的依然是枯草芽孢桿菌-植物乳酸菌組合，小肽總含量（干基）達(dá)12.01%?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶，而植物乳酸菌能產(chǎn)酸性蛋白酶，大分子的蛋白在這些蛋白酶的作用下被降解成動(dòng)物更易吸收的小肽。
3結(jié)論
（1）豆粕經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵后小肽總含量由1.61%提高到8%以上，最高達(dá)13.32%，小肽含量有了極顯著的增加?？莶菅挎邨U菌在混菌中表現(xiàn)優(yōu)秀，可以作為發(fā)酵豆粕的主要菌種。
（2）改進(jìn)過(guò)的發(fā)酵條件更適合工業(yè)化生產(chǎn)，且成本降低。枯草芽孢桿菌-植物乳酸菌的最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵溫度40度、接種量4%、通氣量60g/500ml，料水比1:1.2，小肽總含量由原料的1.61%提高到12.01%。
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