測(cè)序技術(shù)的引入促使miRNA研究領(lǐng)域進(jìn)入快速發(fā)展階段，然而qPCR仍是驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的重要標(biāo)準(zhǔn)。本文將為您介紹使用qPCR進(jìn)行miRNA分析的基本要點(diǎn)，希望能幫助新人快速入門。
什么是miRNA？
miRNA是一類小的非編碼RNA，能夠與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合，通過(guò)作用于mRNA，進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。通常情況下，miRNA-RICS復(fù)合物能夠通過(guò)阻斷靶標(biāo)miRNA的翻譯或促使其降解，從而起到抑制mRNA表達(dá)的作用。多數(shù)miRNA長(zhǎng)度約為18?22個(gè)核苷酸，在樣本中的總RNA量中僅占很小的一部分。通常認(rèn)為總RNA中miRNA的量大約為0.01%(1)。
經(jīng)過(guò)多年研究，一些mRNA與其相應(yīng)miRNA之間的調(diào)控作用已經(jīng)取得了較多的數(shù)據(jù)積累。miRNA參與的生物過(guò)程包括分化、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和宿主感染應(yīng)答。此外，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，miRNA表達(dá)失調(diào)是癌癥等疾病的病因，或是某些疾病的指標(biāo)。循環(huán)miRNA表達(dá)與疾病有關(guān)，并且血清和血漿中能作為檢測(cè)樣本來(lái)源，因此循環(huán)miRNA極有潛力成為疾病相關(guān)生物標(biāo)志物。
目前的miRNA檢測(cè)技術(shù)
探究miRNA在細(xì)胞水平的功能和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制，必須采用適宜的檢測(cè)方法。目前常用的方法包括定量real-time PCR、深度測(cè)序和微芯片。每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，下文會(huì)為您詳細(xì)說(shuō)明。
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）
在《Annual Review of Analytical Chemistry》的一篇文章中提到，“如果選擇一種方法作為miRNA檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，則非RT-qPCR莫屬。(1)”之所以這樣說(shuō)，是因?yàn)閝PCR的多項(xiàng)特性都滿足miRNA檢測(cè)的關(guān)鍵要求：該方法準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)，無(wú)需大量的樣本，并且檢測(cè)范圍靈活。使用qPCR檢測(cè)RNA時(shí)，需要留意若干重要因素，包括RNA的純度與質(zhì)控、cDNA合成、引物設(shè)計(jì)、檢測(cè)和數(shù)據(jù)均一化。檢測(cè)血液中的miRNA時(shí)，數(shù)據(jù)均一化較為挑戰(zhàn)，需要特別考量以進(jìn)行有效的均一化化并獲得有意義的數(shù)據(jù)結(jié)果。
1第一步：cDNA合成
RT-qPCR的第一步是將樣本中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。這一步通常面臨的問(wèn)題包括：(1)模板僅有大約22個(gè)核苷酸，(2)成熟體miRNA、前體miRNA和初級(jí)轉(zhuǎn)錄物并存。
目前逆轉(zhuǎn)錄miRNA主要有兩種方法：
使用不同miRNA的特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
使用樣本中所有miRNA的通用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
每種方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。miRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物能夠有效降低背景噪音，而通用引物則適合于同時(shí)研究多種不同miRNA的情況。通用引物通常需要加入poly(A)尾巴和oligo-dT引物，為后續(xù)所有miRNA的cDNA同時(shí)合成提供基礎(chǔ)。QIAGEN的miScript II RT Kit能夠進(jìn)行簡(jiǎn)便的一步法cDNA合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中所有miRNA的檢測(cè)。該試劑盒含有兩種緩沖液miScript HiSpec Buffer和miScript HiFlex Buffer，能夠特異性的只逆轉(zhuǎn)錄成熟體miRNA或?qū)⑷縍NA轉(zhuǎn)化為cDNA，以滿足不同的研究需求。
2第二步：miRNA特異性引物設(shè)計(jì)
cDNA合成后，即可開始qPCR。在qPCR中需要使用合適的引物。目前常用的兩種miRNA qPCR熒光染料為SYBR Green和雙標(biāo)記水解探針。
SYBR Green為嵌入型染料，結(jié)合在DNA的堿基之間。結(jié)合到dsDNA上之后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約100倍，實(shí)現(xiàn)PCR過(guò)程中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。SYBR Green方法的顯著優(yōu)勢(shì)是無(wú)需為不同miRNA設(shè)計(jì)特異性探針。然而由于SYBR Green法會(huì)檢測(cè)到非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體，需要通過(guò)熔點(diǎn)或熔解曲線分析驗(yàn)證反應(yīng)特異性。在溫度從65?C到95?C的逐漸升溫過(guò)程中，記錄熒光強(qiáng)度，當(dāng)DNA鏈開始解離時(shí)，熒光強(qiáng)度降低(2)。如果熔解曲線只有一個(gè)峰，則表示反應(yīng)中未生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
與SYBR Green法不同，雙標(biāo)記水解探針不會(huì)檢測(cè)非特異性PCR產(chǎn)物，但使用序列特異性探針時(shí)PCR特異性仍然不容忽視——人工產(chǎn)物會(huì)致使真正的PCR產(chǎn)物產(chǎn)量降低。特異性產(chǎn)物和人工產(chǎn)物對(duì)于反應(yīng)成分的競(jìng)爭(zhēng)，可能會(huì)影響分析靈敏度和效率。
3第三步：內(nèi)參RNA的選擇與數(shù)據(jù)均一化
為通過(guò)real-time PCR達(dá)到準(zhǔn)確、可重復(fù)的miRNA定量結(jié)果，需要采用合適的內(nèi)源性參比miRNA對(duì)被測(cè)miRNA的量進(jìn)行均一化。這一方法被稱為相對(duì)定量。均一化能夠避免不準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且可實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)和不同樣本檢測(cè)結(jié)果之間的直接比較。用于real-time PCR miRNA檢測(cè)數(shù)據(jù)均一化化的理想內(nèi)參RNA應(yīng)滿足以下要求：
研究所涉及的所有樣本具有穩(wěn)定的表達(dá)水平
大小與被測(cè)miRNA相似
表達(dá)水平與被測(cè)miRNA相似
在實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)水平不會(huì)被調(diào)控
內(nèi)源性參比RNA和miRNA的引物應(yīng)具有相似的擴(kuò)增效率（接近100%）
二代測(cè)序/RNA-seq
毫無(wú)疑問(wèn)，NGS將成為miRNA研究的主要方法。NGS的成本和所需時(shí)間已經(jīng)顯著下降，miRNA-seq對(duì)于很多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)已不再高不可攀。NGS不會(huì)單純?nèi)〈渌夹g(shù)，而是會(huì)與其他技術(shù)結(jié)合使用。測(cè)序結(jié)果需要驗(yàn)證，qPCR的可靠性使其成為結(jié)果驗(yàn)證的理想選擇。當(dāng)實(shí)驗(yàn)需要序列信息時(shí)，如發(fā)現(xiàn)新型miRNA、探尋isomiRs的影響、或區(qū)分miRNA與其他相似RNA序列，miRNA測(cè)序法便成為研究人員的不二之選。
芯片法
芯片法能夠?qū)σ粋€(gè)樣本中的多種miRNA同時(shí)進(jìn)行分析(1)。微芯片的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)miRNA的種類覆蓋度和定制化檢測(cè)。然而，其劣勢(shì)包括：
微芯片為半定量方法。因此盡管這種方法能比較不同細(xì)胞狀態(tài)的miRNA相對(duì)表達(dá)水平，但需要另外驗(yàn)證，進(jìn)行定量，驗(yàn)證方法包括RT-qPCR(1)
此類實(shí)驗(yàn)需要特定儀器和軟件
這種方法只能用于已知種類的miRNA
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