天然反義轉(zhuǎn)錄物（natural antisense transcripts, NATs）是在自然情況下生物體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性RNA，它們與對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)RNA通過堿基配對(duì)，形成自然正義—反義轉(zhuǎn)錄物配對(duì)的雙鏈RNA，對(duì)器官形成、細(xì)胞分化和疾病發(fā)生等各種生理和病理過程都有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，NATs不是某一特定種類，而是具有一些共同特征、分屬不同種類的RNA。
NATs在哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)廣泛存在，并且大部分轉(zhuǎn)錄單位（TUs）都包含NATs。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)NATs具有多個(gè)活性啟動(dòng)子，這就證明了NATs在哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)廣泛存在的原因。如FANTOM3數(shù)據(jù)庫報(bào)道，小鼠轉(zhuǎn)錄組中70%的轉(zhuǎn)錄單位含有NATs，并且這些轉(zhuǎn)錄物絕大部分是非蛋白編碼RNA。
目前研究證明，不論是正義還是反義RNA均可編碼蛋白或形成非蛋白編碼RNA；但在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，NATs主要以反義非蛋白編碼RNA（Antisense LncRNA）形式存在。Antisense LncRNA的存在給我們以提示： Antisense LncRNA可能會(huì)調(diào)節(jié)蛋白編碼的正義RNA。Antisense LncRNA通常在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控。
本文就Antisense LncRNA的調(diào)控作用作如下綜述。
反義RNA的特點(diǎn)
Antisense LncRNA在基因組中分布極不均勻。Antisense LncRNA常常位于蛋白編碼基因兩端，如Antisense LncRNA在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游250個(gè)核苷酸和基因有義鏈下游富集。由于Antisense LncRNA很少經(jīng)歷剪接事件，從而導(dǎo)致與正義轉(zhuǎn)錄物相比富集程度低。在不同組織和細(xì)胞系中，正義和反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平可以呈正相關(guān)也可以呈負(fù)相關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，人細(xì)胞系A(chǔ)ntisense LncRNA的表達(dá)水平往往與正義基因的表達(dá)有關(guān)；同時(shí)，將內(nèi)源的Antisense LncRNA進(jìn)行基因敲除后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄物出現(xiàn)或升或降的變化；這就表明Antisense LncRNA會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)正義轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行調(diào)節(jié)。
Antisense LncRNA的特性預(yù)示它們?cè)谡{(diào)控基因表達(dá)時(shí)存在一系列的調(diào)控機(jī)制。關(guān)于反義轉(zhuǎn)錄RNA調(diào)控正義mRNA有許多假設(shè)機(jī)制。在此，我們將其歸為四類進(jìn)行討論：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、RNA-DNA相互作用、RNA-RNA核內(nèi)相互作用以及RNA-RNA胞質(zhì)相互作用。
轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)
Antisense LncRNA行使這種調(diào)控機(jī)制，是因?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄方向與正義RNA轉(zhuǎn)錄方向相反，而不是Antisense LncRNA本身的調(diào)節(jié)功能引起的。Antisense LncRNA在轉(zhuǎn)錄過程中可能會(huì)引起正義RNA的改變；下面就轉(zhuǎn)錄碰撞和基因重組兩種模型予以分析（圖1）。
轉(zhuǎn)錄碰撞
在同時(shí)轉(zhuǎn)錄正義RNA和Antisense LncRNA的過程中，兩個(gè)RNA聚合酶分別于正-反義基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，開始合成RNA，并向各自的3’段移動(dòng)，這樣兩個(gè)RNA聚合酶在兩者之間的重疊區(qū)域相遇時(shí)，即開始轉(zhuǎn)錄碰撞，從而抑制它們的轉(zhuǎn)錄過程（圖1a）。運(yùn)用原子力顯微技術(shù)，這種假設(shè)的模型已在Escherichia coli，Saccharomyces cerevisiae中得到證實(shí)。在人和小鼠的基因組轉(zhuǎn)錄時(shí)，轉(zhuǎn)錄碰撞可能是Antisense LncRNA調(diào)控正義轉(zhuǎn)錄物的普遍機(jī)制；但是總的來說，有確鑿數(shù)據(jù)支持的轉(zhuǎn)錄碰撞的實(shí)例非常少。而且，Antisense LncRNA 與其正義基因的轉(zhuǎn)錄可能在時(shí)間上( 不同生長(zhǎng)或發(fā)育階段) 或空間上( 不同染色體) 根本就不可能相遇。這種模型證明了反義RNA是由于與正義RNA轉(zhuǎn)錄方向不同而影響正義RNA的合成。但如上所述，正義和反義RNA經(jīng)常在不同時(shí)間、不同染色體上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所以這種調(diào)控模型并不是Antisense LncRNA調(diào)控基因表達(dá)的主要形式。
圖1.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)模式圖
基因重組
為了適應(yīng)和應(yīng)答外界環(huán)境的各種刺激，B和T淋巴細(xì)胞成熟過程中，在免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因的可變區(qū)經(jīng)常發(fā)生體細(xì)胞超突變(SHM ) 或類型轉(zhuǎn)換重組(CSR) ，以提高抗體對(duì)抗原的親和力，從而產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)；這個(gè)過程是轉(zhuǎn)錄依賴性的。免疫球蛋白可變區(qū)基因的反義轉(zhuǎn)錄能夠使局部的模板DNA 解鏈變?yōu)閱捂淒NA，釋放出空間便于激活誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID) 靠近單鏈DNA，使胞嘧啶脫氨變?yōu)槊撗跄蜞奏? dU )（圖1b）。這一步堿基修飾對(duì)體細(xì)胞超突變是非常重要的。而目前研究表明在可變區(qū)的反義轉(zhuǎn)錄使得AID可以靠近單鏈DNA 。在此模型中，反義轉(zhuǎn)錄打開DNA雙鏈形成單鏈形式，起始AID酶進(jìn)行的調(diào)控，在此過程中會(huì)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而使DNA序列易于重組。在這兩中模型中，起作用的是反義轉(zhuǎn)錄過程本身，而不是由其產(chǎn)生的Antisense LncRNA的調(diào)控作用。
RNA-DNA的相互作用
Antisense LncRNA也可能會(huì)通過表觀遺傳調(diào)控發(fā)揮功能，這種調(diào)控基于直接或間接的RNA-DNA或RNA-染色質(zhì)相互作用。Antisense LncRNA可能會(huì)結(jié)合到相應(yīng)的DNA鏈上產(chǎn)生DNA甲基化（圖2a）或者通過招募組蛋白修飾酶（HME）改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)（圖2b）。與Dicer酶作用機(jī)制不同，Antisense LncRNA會(huì)在局部聚集，從而對(duì)DNA或染色質(zhì)進(jìn)行修飾；這些修飾繼而影響到上述修飾區(qū)域的相鄰區(qū)域，這種第二次修飾可能僅僅限于一個(gè)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，但不斷地發(fā)展下去最終會(huì)影響到整條染色體，如女性中X染色體的失活。
圖2.天然Antisense LncRNA引起染色質(zhì)和DNA表觀遺傳的變化
修飾DNA或染色質(zhì)
Antisense LncRNA可能會(huì)引起DNA甲基化、DNA去甲基化和常染色體基因座非印記修飾等。編碼正義RNA的DNA啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生DNA或染色質(zhì)修飾往往會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄；例如一種Antisense LncRNA會(huì)引起α-血清球蛋白基因（HBA2）甲基化，從而導(dǎo)致HBA2基因沉默。
Antisense LncRNA也會(huì)通過DNA甲基化或形成異染色質(zhì)，從而影響到編碼p15，p21和孕酮受體（PR）的基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄水平的沉默。有義鏈啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3的第27個(gè)氨基酸上三甲基化（H3K27me3）往往抑制正義轉(zhuǎn)錄。如CDKN1A(一種抑癌基因)的Antisense LncRNA通過招募調(diào)節(jié)復(fù)合物誘導(dǎo)H3K27me3，從而抑制有義啟動(dòng)子活性。由于一個(gè)細(xì)胞特定基因只有兩個(gè)DNA拷貝，因此，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)Antisense LncRNA足以結(jié)合到相應(yīng)DNA鏈行使調(diào)控功能。
啟動(dòng)子活性與染色質(zhì)重塑
重疊轉(zhuǎn)錄區(qū)小RNA（＜50nt）、啟動(dòng)子相關(guān)小RNA（PASRs）、終止子相關(guān)小RNA（TASRs）、啟動(dòng)子上游轉(zhuǎn)錄物（PRPMPTs）以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)RNA（TSSa-RNAs）已在人類基因組中報(bào)道。相對(duì)于蛋白編碼基因往3’端轉(zhuǎn)錄，TSSa-RNAs會(huì)在活性啟動(dòng)子兩側(cè)均有轉(zhuǎn)錄。這種異常啟動(dòng)子活性已有充分文獻(xiàn)證實(shí)，并且在50%以上小鼠和人類基因組均有發(fā)現(xiàn)。啟動(dòng)子的這種活性是對(duì)傳統(tǒng)基因認(rèn)識(shí)的一種挑戰(zhàn)，異常的啟動(dòng)子活性暗示了基因不再有明確的5’和 3’端界限的存在。
PROMPTs和TSSa-RNAs的轉(zhuǎn)錄區(qū)域與RNA聚合酶Ⅱ以及活性染色質(zhì)重疊，研究表明這種局部RNA的聚集會(huì)維持染色質(zhì)狀態(tài)，從而有利于啟動(dòng)子的活性。轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)短鏈RNA以及上游基因的轉(zhuǎn)錄往往與活性染色質(zhì)共定位，預(yù)示著這些RNA轉(zhuǎn)錄物不僅會(huì)調(diào)控正義轉(zhuǎn)錄物，還會(huì)參與染色體的重塑。
基因組印記
在大多數(shù)情況下，親本源的基因均等表達(dá)；但在印記基因中，僅特異地表達(dá)父源或母源的等位基因。研究發(fā)現(xiàn)，Antisense LncRNA往往與基因印記有關(guān)，兩者之間的相關(guān)度在81%以上。如父源表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體2反義RNA（Airn） 通過重疊Igf2r 啟動(dòng)子區(qū)域抑制RNA 聚合酶Ⅱ的募集，最終抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子2型受體（Igf2r）的表達(dá)。目前已在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)160余種印記基因。
X染色體失活
X 染色體失活過程是指雌性哺乳動(dòng)物中的兩條X 染色體中的一條隨機(jī)失活，以達(dá)到雄性和雌性中表達(dá)等量的X 關(guān)聯(lián)基因。來自X 染色體失活中心的兩個(gè)長(zhǎng)鏈非蛋白編碼基因，即X 染色體特異性失活轉(zhuǎn)錄物(Xist) 和Xist 的Antisense LncRNA(Tsix) 共同控制著X 染色體的失活。Xist 的表達(dá)只來源于失活的X 染色體，通過結(jié)合PRC2 復(fù)合物，以催化形成H3K27me3，并使PRC2 復(fù)合物作用于X 染色體，改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。Tsix通過對(duì)Xist啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，抑制Xist 的活性，與后者共同調(diào)控X 染色體失活過程。
RNA-RNA核內(nèi)相互作用
這種機(jī)制基于核內(nèi)反義和正義RNA會(huì)形成二聚體（圖3Aa）。RNA二聚體的形成會(huì)對(duì)正義mRNA的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。核內(nèi)RNA二聚體的形成會(huì)封閉剪接位點(diǎn)，影響mRNA 前體的剪接過程，產(chǎn)生不同的mRNA 成熟體。
選擇性剪接
Antisense LncRNA與正義RNA結(jié)合形成二聚體會(huì)封閉剪接位點(diǎn)，從而改變不同剪接體之間的平衡（圖3Ab）。例如甲狀腺激素受體有TRα1 和TRα2 兩種可變剪接體，二者在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平保持一定比例，功能上是拮抗的。TRα2 的反義鏈表達(dá)Antisense LncRNA RevErbAα，對(duì)TRα2 5’剪接位點(diǎn)的活性有影響，可導(dǎo)致TRα2 的mRNA 水平下調(diào)，改變與TRα1 的比例，調(diào)節(jié)甲狀腺激素受體在不同組織或生理?xiàng)l件下的功能狀。此外，Antisense LncRNA還會(huì)通過類似途徑引起聚腺苷酸化影響基因的轉(zhuǎn)錄。
mRNA的運(yùn)輸與Antisense LncRNA核滯留
反義和正義RNA二聚體的形成會(huì)影響到mRNA的核運(yùn)輸；此外，核內(nèi)蛋白質(zhì)或其他RNAs的相互作用會(huì)引起Antisense LncRNA在核內(nèi)滯留，然而目前尚不明確其中的機(jī)制。Antisense LncRNA主要存在與細(xì)胞核內(nèi)行使調(diào)節(jié)功能，諸如低氧、血清饑餓、過氧化物等細(xì)胞壓力因子的存在會(huì)改變核內(nèi)Antisense LncRNA的存在模式，從而改變相應(yīng)正義RNA的水平。
mRNA的編輯
Antisense LncRNA還會(huì)影響到mRNA編輯（圖3Ac），如黑腹果蠅中的一個(gè)基因Rnp4f與其反義轉(zhuǎn)錄本Sas10，在它們的重疊區(qū)會(huì)對(duì)Rnp4f的mRNA進(jìn)行腺苷脫氨基至肌苷的轉(zhuǎn)換。果蠅的Sas-10 是Rnp4f 基因的Antisense LncRNA，二者形成雙鏈RNA，在ADAR 的作用下使4f-rnp 的部分腺嘌呤轉(zhuǎn)換為次黃嘌呤，并且導(dǎo)致4f-rnp mRNA 水平的降低。
圖3.核內(nèi)和胞質(zhì)中正義-反義RNA相互配對(duì)形成二聚體
RNA-RNA胞質(zhì)相互作用
這種機(jī)制是基于反義RNA和正義RNA在胞質(zhì)內(nèi)形成二聚體（如圖3Ba-c），形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)影響正義mRNA的穩(wěn)定性和翻譯；或者，該二聚體可能會(huì)封閉miRNA結(jié)合位點(diǎn)；或這，作為發(fā)夾模板產(chǎn)生內(nèi)源性siRNAs。
影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯
在胞漿中，Antisense LncRNA 通過與正義鏈mRNA 結(jié)合形成雙鏈而影響后者的穩(wěn)定性和翻譯效率。兩者的結(jié)合區(qū)域通過降低mRNA衰退、影響mRNA的穩(wěn)定性；或者，mRNA此區(qū)域通過多種RNases進(jìn)行一系列內(nèi)外源核苷酸的剪切而降解。如β位點(diǎn)淀粉樣蛋白前體裂解酶1(BACE1) 基因的Antisense LncRNA BACE1-AS 與BACE1 第6 外顯子完全重疊，二者形成二聚體可能改變了BACE1的次級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了BACE1 mRNA的穩(wěn)定性。
當(dāng)生物體遭受內(nèi)外毒素、炎癥反應(yīng)等刺激時(shí)，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(INOS) 會(huì)被大量合成，以產(chǎn)生足量的一氧化氮發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用。INOS 基因的天然Antisense LncRNA通過與人抗原HuR 相互作用，能夠使INOS mRNA 免受核酸酶攻擊，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性，保證一氧化氮合酶的產(chǎn)生能滿足細(xì)胞代謝的需要。HIF1αAntisense LncRNA αHIF 可以與其3′UTR 的序列結(jié)合，改變局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，使ARE 元件暴露，HIF1αmRNA 在核酸酶的作用下降解。
Antisense LncRNA還會(huì)抑制翻譯，如B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）基因的Antisense LncRNA抑制BCMA 翻譯，卻不會(huì)造成BCMA mRNA 水平的變化； 顯然它是在翻譯水平調(diào)控BCMA 的表達(dá)。另一個(gè)顯著的例子是：轉(zhuǎn)錄因子PU. 1 的反義RNA 分子可以在翻譯的起始和延伸之間抑制翻譯的進(jìn)行，形成的二聚體會(huì)影響與核糖體的結(jié)合，從而下調(diào)PU. 1 的表達(dá)，但對(duì)PU. 1 的mRNA 水平?jīng)]有影響。
封閉miRNA結(jié)合位點(diǎn)
Antisense LncRNA與其相應(yīng)正義RNA形成的二聚體會(huì)封閉miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)來維持正義轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。以BACE1為例，其Antisense LncRNA不僅會(huì)增強(qiáng)BACE1 mRNA的穩(wěn)定性（如前文），還會(huì)通過覆蓋BACE1 mRNA 的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)以阻止miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制。FANTOM3數(shù)據(jù)庫報(bào)道，至少34%的天然Antisense LncRNA與正義mRNA 3’UTR區(qū)域可能形成二聚體；而mRNA 3’UTR區(qū)域往往含有miRNA作用的靶位點(diǎn)，所以天然Antisense LncRNA會(huì)與miRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3’UTR同一區(qū)域，以維持mRNA的穩(wěn)定性。
內(nèi)源siRNA的形成
Antisense LncRNA與其正義RNA形成的雙鏈RNA，很可能會(huì)在Dicer 的加工下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA，從而調(diào)控基因表達(dá)。如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一些蛋白編碼基因及其反義RNA 可生成內(nèi)源性siRNA，通過選擇性的降解P5CDH mRNA，使細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸水平升高以增強(qiáng)擬南芥的抗鹽堿。而且，擬南芥中64%以上的蛋白編碼基因可以與相應(yīng)的Antisense LncRNA結(jié)合會(huì)生成內(nèi)源siRNA。
類似的發(fā)現(xiàn)還有，在X 染色體失活過程中，Tsix 與Xist 形成雙鏈，并傾向形成siRNA；在小鼠卵母細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)Antisense LncRNA形成內(nèi)源性siRNA。該發(fā)現(xiàn)，從另一個(gè)方面詮釋了Antisense LncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用及其與其它RNA 之間的相互關(guān)系。
結(jié)語
前文中，我們就Antisense LncRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能機(jī)制提出了四種模型，并且每種模型都列舉了詳盡的例子予以闡述。在這四種模型中，如上文所述，轉(zhuǎn)錄碰撞模型是不常見的一種調(diào)控機(jī)制；核內(nèi)和胞質(zhì)RNA-RNA之間的相互作用會(huì)產(chǎn)生如RNA編輯、剪接等結(jié)果，但也不是Antisense LncRNA的主要調(diào)控方式。此外，在RNA與DNA相互作用模型中，Antisense LncRNA引起DNA甲基化缺乏大量文獻(xiàn)的報(bào)道，這種調(diào)節(jié)可能僅僅發(fā)生在一些特定的發(fā)育階段。相反，反義RNA引起的染色體重組可能是許多低拷貝Antisense LncRNA調(diào)控的最主要機(jī)制；在這種模型中，反義RNA修飾染色體結(jié)構(gòu)，最終抑制有義基因的表達(dá)。盡管目前研究表明天然Antisense LncRNA參與多種基因調(diào)控通路，但其具體的分子特性目前尚不明確。
雖然目前對(duì)天然Antisense LncRNA產(chǎn)生及作用的機(jī)制并不完全清楚，但可以肯定的是：它的調(diào)控作用在人類基因組中無處不在。目前已有很多研究證實(shí)Antisense LncRNA對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的產(chǎn)生發(fā)展有重要的調(diào)控作用。如擾亂這些Antisense LncRNA的產(chǎn)生，則會(huì)擾亂正義RNA的正常表達(dá)，從而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及疾病等產(chǎn)生影響。深入挖掘這些Antisense LncRNA的調(diào)控機(jī)制必將為相關(guān)疾病的臨床治療帶了新的突破口，為人類身體健康帶來新的福祉。
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