撰文丨張先榮 （南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院）
點(diǎn)評丨秦 聆 （賓夕法尼亞大學(xué)）
羅 劍 （華東師范大學(xué)）
MicroRNAs (miRNAs) 是一類進(jìn)化上較保守的非編碼小分子RNAs，大約22個(gè)核苷酸，由前體轉(zhuǎn)錄本通過剪切加工而成。miRNA片斷上的種子區(qū)域（seed region，一般為miRNA的 2-7位堿基）與mRNA上的靶序列嚴(yán)格互補(bǔ)配對，通過靶向抑制mRNA翻譯或降解mRNA而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA的表達(dá)和功能具有組織和細(xì)胞特異性，調(diào)節(jié)多種生理和病理過程。在腫瘤、代謝性疾病和感染性疾病的臨床前開發(fā)和臨床試驗(yàn)研究中，miRNAs作為治療靶標(biāo)或診斷生物標(biāo)志物已取得突破性進(jìn)展，具有良好應(yīng)用前景。但是，調(diào)節(jié)骨代謝疾病的關(guān)鍵miRNAs尚有待深入研究。
不久前，紐約特種外科醫(yī)院（Hospital for Special Surgery）、威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院（Weill Cornell Medical College）趙寶紅課題組在Nat Commun在線發(fā)表了題為Bone protection by inhibition of microRNA-182的研究論文。該研究最新發(fā)現(xiàn)，無論是在生理性骨代謝過程中，還是在骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）或風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）等病理情況下，miR-182是正向調(diào)控破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。該研究證明雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（protein kinase double-stranded RNA-dependent，PKR）是miR-182調(diào)控破骨細(xì)胞分化的新靶標(biāo)。miR-182通過抑制PKR表達(dá)而下調(diào)內(nèi)源性干擾素-γ （interferon-β，IFN-β）的自分泌反饋環(huán)路，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。
趙寶紅課題組長期從事miR-182調(diào)控破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制研究。繼2016年發(fā)表于J Immunol的關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子RBP-J通過調(diào)節(jié)miR-182促進(jìn)TNF-α所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的工作后【1】，此次研究進(jìn)一步揭示了miR-182在絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松癥和RA發(fā)生中的作用和機(jī)制。首先，課題組采用原代破骨細(xì)胞前體即骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs），以核因子κB受體激活因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）誘導(dǎo)其破骨細(xì)胞成熟分化，發(fā)現(xiàn)miR-182在誘導(dǎo)后48小時(shí)和72小時(shí)呈顯著高表達(dá)。進(jìn)而分別通過破骨前體細(xì)胞特異性敲除Mir182的小鼠（Mir182△M/△M）（圖1）和Mir182轉(zhuǎn)基因小鼠（Mir182mTg），采用TRAP染色、破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)志基因表達(dá)檢測、骨微結(jié)構(gòu)分析等實(shí)驗(yàn)，證明miR-182是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的正向調(diào)控子，參與調(diào)控骨代謝平衡。
圖1：miR-182促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)骨代謝
為明確miR-182在病理性骨量丟失中的作用，課題組通過Mir182△M/△M敲除小鼠和Mir182mTg過表達(dá)小鼠，采用卵巢切除（ovariectomy, OVX）所誘導(dǎo)的絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松癥模型、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的炎癥性骨量丟失模型、kBxN血清所誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（圖2），研究骨表型改變。結(jié)果表明，Mir182△M/△M小鼠對OVX、LPS、kBxN血清所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨量丟失具有明顯耐受性。反之，TNF-α處理可進(jìn)一步激活Mir182mTg小鼠的破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨溶解。課題組還采用納米殼聚糖（chitosan, CH）作為載體，包裝miR-182抑制子寡核苷酸，通過尾靜脈注射用藥，驗(yàn)證了靶向抑制miR-182對于改善OVX或炎癥所致病理性骨量丟失的治療價(jià)值。
圖2：miR-182缺失可改善病理性破骨細(xì)胞分化和骨丟失
miR-182如何調(diào)控破骨細(xì)胞分化？課題組分離野生型及Mir182△M/△M小鼠破骨前體細(xì)胞，采用高通量分析比較，證明miR-182缺失可顯著阻斷RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)基因和標(biāo)志基因的表達(dá)。應(yīng)用Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)，miR-182缺失可上調(diào)防御反應(yīng)基因的表達(dá)，特別是干擾素-β（interferon-β，IFN-β）。基因富集分（gene set enrichment analysis，GSEA）也顯示，在RANKL誘導(dǎo)下，Mir182△M/△M細(xì)胞最顯著富集的基因集為I型干擾素（type I interferons，IFN）基因（圖3）。由于內(nèi)源性IFN-β是RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)【2, 3】，Mir182△M/△M細(xì)胞所表現(xiàn)的IFN反應(yīng)基因的富集效應(yīng)可能為miR-182缺失進(jìn)一步放大了RANKL所誘導(dǎo)的IFN通路反應(yīng)所致。
圖3: miR-182通過靶向PKR調(diào)節(jié)內(nèi)源性IFN-β
為明確miR-182調(diào)控破骨細(xì)胞分化的靶標(biāo)基因，課題組分離野生型與miR-182功能缺失型（Mir182△M/△M），野生型與miR-182功能獲得型（Mir182mTg）兩組小鼠BMMs，應(yīng)用RNA組學(xué)測序和差異表達(dá)分析，并與其他已發(fā)表數(shù)據(jù)庫結(jié)果【4】比較，證明miR-182的潛在靶標(biāo)基因?yàn)榫幋aPKR的Eif2ak2基因。進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因分析，明確了miR-182結(jié)合Eif2ak2基因3’UTR的種子區(qū)域。由于PKR在I型IFN通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可激活I(lǐng)FN-β表達(dá)【5, 6】。課題組深入研究采用PKR敲除小鼠和Mir182△M/△M小鼠，分別聯(lián)合IFN-β中和抗體，闡釋了miR-182直接靶向下調(diào)PKR表達(dá)，進(jìn)而抑制RANKL所誘導(dǎo)的內(nèi)源性IFN-β表達(dá)，從而下調(diào)破骨細(xì)胞分化過程中的抑制性環(huán)路功能，激活破骨細(xì)胞分化（圖4）。
圖4： miR-182靶標(biāo)PKR通過調(diào)節(jié)IFN-β反饋環(huán)路抑制破骨細(xì)胞生成
該論文最后應(yīng)用臨床RA患者標(biāo)本，證明miR-182-PKR-IFN-β調(diào)節(jié)軸還與RA發(fā)生具有高度相關(guān)性。與健康對照相比，RA患者CD14(+) 外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的miR-182呈顯著高表達(dá)，而PKR和IFN-β水平明顯降低。采用臨床RA治療最成功的TNF阻斷療法發(fā)現(xiàn)，TNF阻斷治療可顯著降低患者CD14(+) PBMCs細(xì)胞的miR-182表達(dá)，并上調(diào)PKR和IFN-β表達(dá)，且顯著抑制其破骨細(xì)胞分化。
本研究由趙寶紅教授指導(dǎo)第一作者Kazuki Inoue博士和其他研究室成員完成。趙寶紅教授是文章的獨(dú)立通訊作者。
專家點(diǎn)評
秦聆（賓夕法尼亞大學(xué)）
骨重建的穩(wěn)態(tài)依賴于破骨細(xì)胞的骨吸收功能和成骨細(xì)胞的骨形成功能。破骨細(xì)胞是骨組織中唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，由髓系造血前體細(xì)胞（hematopoietic myeloid precursors）在RANKL作用下分化成熟并被激活。破骨細(xì)胞的過度激活在多種骨破壞性疾病如RA和婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。該研究首次系統(tǒng)闡釋了miR-182-PKR-IFN-β調(diào)節(jié)軸在RANKL所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，以及骨代謝和骨溶解性疾病發(fā)生中的作用。miR-182在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和RA患者的系統(tǒng)研究數(shù)據(jù)提供了其成為絕經(jīng)性骨量丟失和炎癥性骨溶解新靶點(diǎn)的證據(jù)，同時(shí)也為基于干預(yù)miR-182開發(fā)新型抗骨溶解藥物提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
羅劍 （華東師范大學(xué)）
破骨細(xì)胞的過度活化與骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎等人類疾病密切相關(guān)，而系統(tǒng)研究microRNA參與調(diào)控破骨細(xì)胞活化還鮮有報(bào)道。美國紐約特種外科醫(yī)院（康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，全美骨科排名第一醫(yī)院）的趙寶紅教授實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)研究了microRNA-182在破骨細(xì)胞中的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)它能通過靶向PKR從而調(diào)控IFNb信號通路，進(jìn)而調(diào)控破骨細(xì)胞的生理和病理活化。本項(xiàng)研究至少有四點(diǎn)重要意義：第一，該研究利用大量小鼠體內(nèi)遺傳學(xué)手段（破骨細(xì)胞特異敲除和破骨細(xì)胞特異過表達(dá)）和藥理學(xué)手段（microRNA抑制劑），利用多種疾病動(dòng)物模型（卵巢切除模型和炎癥因子誘導(dǎo)模型），充分無疑的證明了miR-182對體內(nèi)、體外破骨細(xì)胞的生理和病理活化具有至關(guān)重要的調(diào)控作用。第二，最出彩的是本項(xiàng)研究的臨床和轉(zhuǎn)化研究，作者發(fā)現(xiàn)miR-182-PKR-IFNb信號軸的表達(dá)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中破骨細(xì)胞活化密切相關(guān)，并且miR-182抑制劑在動(dòng)物模型中對破骨細(xì)胞相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎等具有驚人的防治效果，值得一提的是，作者通過FDA批準(zhǔn)的幾丁質(zhì)納米顆粒包裹，更能提高miR-182抑制劑的效果，為該項(xiàng)研究的轉(zhuǎn)化提供了很大的想象空間。第三，本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的破骨細(xì)胞調(diào)控通路miR-182-PKR-IFNb，為人們理解IFNb在破骨細(xì)胞中的重要作用提供依據(jù)。第四，本項(xiàng)研究是繼2014年德州醫(yī)學(xué)中心萬誼虹教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)miR-34a參與調(diào)控破骨細(xì)胞生理和病理活化（Nature 2014 512:431-5.）后的又一重要發(fā)現(xiàn)，但是這兩篇研究各有側(cè)重，萬誼虹教授發(fā)現(xiàn)miR-34a能抑制破骨細(xì)胞活化，因此利用miR-34a本身能治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病包括骨質(zhì)疏松和腫瘤骨轉(zhuǎn)移。而本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-182促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，因此需要抑制miR-182來治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病，且本項(xiàng)研究更側(cè)重從臨床疾病中發(fā)現(xiàn)miR-182具有重要作用?？偟膩碚f，該項(xiàng)研究堪稱破骨細(xì)胞研究的范本，邏輯流暢，方法恰當(dāng)，分析合理，一氣呵成。
參考文獻(xiàn)
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