2015年生命科學(xué)突破獎（Breakthrough Prize in Life Sciences）授予6位科學(xué)家（每位獲獎?wù)?00萬美元），其中兩位女性為加州大學(xué)伯克利分校的美國生物化學(xué)家杜德娜（Jennifer Anne Doudna）和德國漢諾威醫(yī)學(xué)院/赫爾姆霍茨感染研究中心的法國生物化學(xué)家卡彭蒂耶(Emmanuelle Marie Charpentier)，以表彰她們在“具有潛在革命性DNA編輯工具——CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)明中的重要貢獻(xiàn)”。
1 CRISPR的發(fā)現(xiàn)
1987年，日本微生物學(xué)家石野良純（Yoshizumi Ishino）課題組在克隆大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶（alkaline phosphatase isozyme, iap）基因編碼序列時，意外發(fā)現(xiàn)編碼序列附近存在間隔串聯(lián)重復(fù)（5個）的DNA片段，每個重復(fù)片段含29個保守堿基且具有內(nèi)部堿基互補(bǔ)的回文結(jié)構(gòu)，這些保守片段之間由32個堿基的居間序列隔開，對這種結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能卻一無所知。
90年代，研究人員先后在多種細(xì)菌和古菌基因組中發(fā)現(xiàn)這種特殊的串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，因此2000年將其統(tǒng)稱為短規(guī)律性間隔重復(fù)（short regularly spaced repeat, SRSR）序列。2002 年，荷蘭烏得勒支大學(xué)揚(yáng)森（Ruud Jansen）正式將這種結(jié)構(gòu)命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)。在研究CRISPR序列過程中還發(fā)現(xiàn)許多與這些序列功能存在關(guān)聯(lián)的核酸酶或螺旋酶，統(tǒng)稱為CRISPR-相關(guān)因子（CRISPR-associated,Cas），從而在細(xì)菌中鑒定出一個全新的CRISPR-Cas系統(tǒng)。
2. CRISPR系統(tǒng)生物學(xué)功能的闡明
2005年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)CRISPR中的居間序列并非細(xì)菌自身染色體所擁有，反而和細(xì)菌病毒（噬菌體）和染色體外DNA（質(zhì)粒）序列更為相似。基于這一事實，科學(xué)家推測CRISPR-Cas可能是細(xì)菌的一種適應(yīng)性防御系統(tǒng)：細(xì)菌通過特定方式獲取噬菌體DNA片段并將其整合到自身CRISPR序列，從而對外源入侵病毒產(chǎn)生“記憶”，當(dāng)噬菌體再次感染時，細(xì)菌利用這些序列信息來識別入侵者并將其破壞。
2007年，一項研究表明感染烈性噬菌體后的細(xì)菌大部分死亡，保留下來的“幸運(yùn)”細(xì)菌則獲得對同株噬菌體再次感染的抗性。對這些細(xì)菌基因組分析發(fā)現(xiàn)其CRISPR居間序列中存在噬菌體序列，去除這些序列可造成細(xì)菌噬菌體抗性消失；而將這些序列直接整合到未感染過噬菌體的細(xì)菌CRISPR，則細(xì)菌對首次噬菌體感染也擁有抗性，從而證實了CRISPR居間序列的重要作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌獲得抗性的原因在于具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白可特異性將與居間序列互補(bǔ)配對的噬菌體DNA雙鏈在特定位置切開，從而造成噬菌體DNA雙鏈斷裂，消除潛在威脅。
這一系列研究表明CRISPR-Cas是一種全新的細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)，細(xì)菌通過該系統(tǒng)可實現(xiàn)自我保護(hù)作用，這一現(xiàn)象的直接用途就是通過改造細(xì)菌基因組而獲得抵抗噬菌體能力，減少工程菌死亡，而更為重要的用途則是隨后發(fā)明的基因編輯技術(shù)。
3. CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明
卡彭蒂耶的研究重點是感染性疾病分子生物學(xué)，28歲放棄舞蹈開始在巴黎皮埃爾和瑪麗居里大學(xué)鉆研生物化學(xué)和微生物學(xué)，后在巴斯德研究所完成博士學(xué)位。在完成博士后培訓(xùn)后進(jìn)入瑞典于默奧大學(xué)（Ume? University）開展獨(dú)立研究?？ㄅ淼僖嚓P(guān)注的是細(xì)菌抵御病毒侵染的分子機(jī)制，隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，她的研究小組迅速投入該領(lǐng)域，初步闡明CRISPR來源RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA)的生成和作用?？ㄅ淼僖〗M研究發(fā)現(xiàn)一種反式激活crRNA（trans-activating crRNA, tracrRNA）可與Cas蛋白參與RNA酶III對CRISPR轉(zhuǎn)錄出序列的選擇性酶切而產(chǎn)生crRNA，隨后Cas蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復(fù)合物可對與crRNA配對的外源DNA實施剪切。
杜德娜主要研究方向為RNA介導(dǎo)基因調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，并擁有完美學(xué)術(shù)生涯，其博士導(dǎo)師是哈佛大學(xué)紹斯塔克（Jack Szostak，2009年“由于端粒的發(fā)現(xiàn)”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎），而博士后指導(dǎo)教師為科羅拉多大學(xué)切赫（Thomas Cech，1989年“由于核酶的發(fā)現(xiàn)”而分享諾貝爾化學(xué)獎），其優(yōu)勢在于擁有堅實的分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)等研究基礎(chǔ)。2007年，杜德娜小組開始研究CRISPR-Cas系統(tǒng)，重點在于闡明Cas酶催化crRNA形成和靶DNA鏈斷裂過程的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。
2011年，細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas作用機(jī)制被基本闡明，從而為進(jìn)一步應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。CRISPR-Cas發(fā)揮作用主要有三個步驟：首先，外源DNA部分短序列作為間隔序列插入細(xì)菌染色體DNA形成CRISPR；隨后，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成crRNA前體，借助RNA酶III完成crRNA成熟；最后，crRNA區(qū)間序列與外源DNA互補(bǔ)配對從而啟動Cas蛋白催化的DNA剪切。并且發(fā)現(xiàn)存在三類CRISPR-Cas系統(tǒng)，其中Ⅱ類系統(tǒng)最為簡單，只需要一種Cas蛋白——Cas9即可完成DNA識別和剪切，更適合于實際操作。
從這個角度來看，CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌限制-修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用過程具有異曲同工之妙。限制-修飾系統(tǒng)是細(xì)菌對自身DNA進(jìn)行修飾（甲基化），對外源DNA則借助限制性內(nèi)切酶識別（不識別修飾后的自身DNA）和剪切而抵御感染。后來發(fā)現(xiàn)也存在三類限制性內(nèi)切酶，而Ⅱ類內(nèi)切酶由于識別和剪切在相同位置而被廣泛應(yīng)用。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)榮獲1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，而利用限制性內(nèi)切酶首次實現(xiàn)DNA重組則分享1980年諾貝爾化學(xué)獎。
2011年，卡彭蒂耶和杜德娜在波多黎各學(xué)術(shù)會議上相識，研究方向的一致性和研究內(nèi)容的互補(bǔ)性使二人決定開展緊密合作，以將細(xì)菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用于DNA編輯，并與2012年首次實現(xiàn)突破。兩個小組對天然CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)改造，將tracrRNA和crRNA雙組分利用基因工程整合為一條鏈，稱為單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA, sgRNA)，該RNA擁有兩個特性，一個位于5’端與靶序列互補(bǔ)的20個核苷酸（crRNA作用），另一個為3’端被Cas9識別的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)（tracrRNA作用）。改造后用于特定DNA編輯技術(shù)的CRISPR-Cas9基本原理在于：sgRNA與靶DNA相應(yīng)序列互補(bǔ)配對可啟動核酸內(nèi)切酶Cas9的雙鏈切割活性，一方面Cas9的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)gRNA互補(bǔ)鏈DNA切開，另一方面RuvC樣結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)將非互補(bǔ)鏈DNA切開。卡彭蒂耶和杜德娜聯(lián)合小組首次在試管內(nèi)完成DNA精確切割，奠定了DNA編輯技術(shù)基礎(chǔ)，開拓了一個全新領(lǐng)域，這項突破也成為CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)明的一個里程碑。2013年初，兩個小組進(jìn)一步利用CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)DNA精確編輯，隨后引發(fā)一個井噴式發(fā)展，通過改造還可實現(xiàn)基因表達(dá)的激活或抑制調(diào)控。
4. 展望
CRISPR-Cas9技術(shù)在DNA編輯方面的簡潔和高效使其迅速成為當(dāng)前生命科學(xué)最為炙手可熱領(lǐng)域之一，已廣泛應(yīng)用于多種模式生物包括酵母、斑馬魚、果蠅、線蟲、小鼠、恒河猴等的基因組改造。CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域包括細(xì)胞和動物模型建立、功能基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表觀調(diào)控、細(xì)胞基因組活性成像和靶向治療等。由于技術(shù)本身存在脫靶效應(yīng)，因此在臨床應(yīng)用安全性方面尚待進(jìn)一步完善和改進(jìn)，但其強(qiáng)大的作用效果將為單基因甚至多基因遺傳病治療提供全新模式。
杜德娜和卡彭蒂耶除分享2015年生命科學(xué)突破獎外還共同分享多項榮譽(yù)，如共同入選《時代》雜志2015年世界最有影響百人。隨著CRISPR-Cas9技術(shù)重要性的日益體現(xiàn)，兩位科學(xué)家也將成為諾貝爾獎（化學(xué)獎可能性更大）熱門候選之一，不遠(yuǎn)的將來也將斬獲這項科技界最高桂冠。
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