密歇根大學(xué)Muneesh Tewari博士最近的研究發(fā)現(xiàn)，RNA測序文庫制備方法可能對microRNA定量不一致。該研究評估了9個實驗室提供的結(jié)果，描述了可以減少流程和序列特異性偏差的文庫制備方法，從而提高測序準確性和相似性。
在microRNA（miRNA）分析中，研究人員會遇到一個好的和不利的情況。好的方面是：miRNA圖譜在生物標志物發(fā)現(xiàn)中顯示出了巨大的前景。不利的情況是：不同研究團隊生成的miRNA圖譜并不總是重疊的。
問題在于miRNA分子由很短的核苷酸序列組成，它們對探針設(shè)計和標記選擇提出了挑戰(zhàn)。不同miRNA在退火反應(yīng)中的解鏈溫度可能存在很大的差異，它們的濃度可能是按數(shù)量級變化的，并且它們很難與miRNA前體和轉(zhuǎn)錄后修飾產(chǎn)生的變體區(qū)分開。因此，鑒定和定量miRNA分子本質(zhì)上具有挑戰(zhàn)性。
問題的另一個方面是，miRNA存在于不同的組織、分離的細胞和細胞外囊泡中，并且在生物流體中游離時會與蛋白質(zhì)結(jié)合。不同的miRNA樣本類型需要不同類型的提取技術(shù)，即使是同種類型的提取技術(shù)也可能存在微小但最終意義重大的變化，導(dǎo)致不同的結(jié)果。其他變化的來源還包括miRNA測量和數(shù)據(jù)解釋。
為了克服這些可變性，從而找到更多需要的共同點，研究人員正在努力標準化miRNA的分析流程方案，協(xié)調(diào)來自不同研究團隊的研究結(jié)果，并開發(fā)能夠提供可靠診斷和預(yù)后結(jié)果的應(yīng)用程序。隨著此項工作的推進，逐步實現(xiàn)了miRNA作為生物標志物的潛力，這些標志物已在最近的許多研究中得到證實。
MicroRNA作為生物標志物
許多研究表明miRNA圖譜可能因健康狀況不同而有所差異。這一點很容易得到證實。只需要打開搜索引擎并輸入幾個關(guān)鍵術(shù)語：miRNA、生物標記物、綜述和癌癥-或者其他疾病，如心血管疾病或神經(jīng)退行性疾病。
除了回顧，還可以查閱目前關(guān)于miRNA生物標志物研究的最新報道。例如，在過去一年中，發(fā)表了針對以下情況的新發(fā)現(xiàn)：
支氣管肺發(fā)育不良，可導(dǎo)致低出生體重嬰兒死亡或長期疾病（阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校，JCI Insight）。
心房顫動是一種心律失常，常因缺乏癥狀而被忽視（東京醫(yī)科大學(xué)，Circulation）。
盧伽雷氏病（Lou Gehrig?。?，或肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS），一種破壞神經(jīng)細胞并導(dǎo)致永久性殘疾的神經(jīng)退行性疾?。ㄒ陨刑乩S夫大學(xué)，The Journal of Neuroscience）。
與睡眠剝奪有關(guān)的認知表現(xiàn)缺陷。（賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院，SLEEP 2018）。
阿爾茨海默病（印第安納大學(xué)，Nature Scientific Reports）。
膿毒癥是一種極端且危及生命的感染反應(yīng)，可引發(fā)全身炎癥（哥倫比亞大學(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心，Nature）。
血液興奮劑，輸注自體紅細胞以增強運動表現(xiàn)（杜克大學(xué)，British Journal of Haematology）。
MicroRNA分析要略
MicroRNA是一種長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，通過與mRNA結(jié)合、抑制其翻譯或?qū)е缕浣到鈦碚{(diào)控基因表達。盡管目前發(fā)現(xiàn)的miRNA并不是特別多（只有大約1000個被認為是來自人類基因組），但每個miRNA可能調(diào)節(jié)數(shù)百個mRNAs。因此，miRNA參與許多生物學(xué)過程，包括細胞分化、增殖和凋亡。
當(dāng)miRNA表達出錯時，可能引起包括基因表達的失調(diào)，這反過來會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。幸運的是，miRNA在各種樣本類型中（液體活檢樣本以及新鮮和固定的組織樣本）相對穩(wěn)定，這提高了miRNA能夠被充分定量以便識別疾病特征的可能性。
MicroRNA定量和分析要略可以從許多來源進行研究，包括美國弗雷德·哈欽森癌癥研究中心Muneesh Tewari博士研究團隊發(fā)表在Nature Reviews Genetics中的一篇權(quán)威文章。概述了不同樣本類型的miRNA分析工作流程，強調(diào)了質(zhì)量控制的重要性，并總結(jié)了主要的miRNA定量技術(shù)。工作流程包括：
純化技術(shù)（例如凝膠電泳、免疫沉淀和激光捕獲顯微切割）。
質(zhì)量控制檢查（例如測量spike-in寡核苷酸濃度或管家RNA表達、分光光度分析、或自動毛細管電泳）。
MicroRNA測量技術(shù)（例如基于qRT-PCR的方法、基于雜交的方法和RNA測序）。
RNA分析工作流程
專家評論——關(guān)于目前miRNA研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向
Promega高級研究科學(xué)家，Douglas Horejsh博士
Luminex高級現(xiàn)場應(yīng)用科學(xué)家，Stephen Angeloni博士
1、哪種類型的工具和試劑對miRNA研究至關(guān)重要？
Dr. Horejsh：有效、安全且可重復(fù)的miRNA純化工具在此過程中至關(guān)重要。顯然，如果存在特定miRNA的純化偏差或miRNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離效率低下，則很難進行生物標志物的發(fā)現(xiàn)。
Dr. Angeloni：對于miRNA的原位雜交檢測，正確的樣品制備和具有良好信噪比和特異性的探針是至關(guān)重要的。對于PCR和測序技術(shù)，第一個限制因素是從不同樣品中分離出足夠量的高質(zhì)量RNA。對于其中一些分子技術(shù)，下一個關(guān)鍵因素是要有有效的擴增接頭或良好的莖環(huán)引物，以便準確地將miRNA轉(zhuǎn)化為可用于分析的cDNA。
2、目前用于miRNA研究的工具和試劑有哪些局限性?
Dr. Horejsh：目前用于外泌體純化的標準方法是超速離心。這種方法可靠，但也很繁瑣且耗時。它也不適合高通量。無需超速離心即可沉淀外泌體的試劑將使外泌體純化更加快速且自動化。然而，基于外泌體純化方法的miRNA表達似乎存在差異。此外，目前市場上大多數(shù)miRNA純化工作流程都是完全手動的。將這種類型的工作流程應(yīng)用到大型生物標志物發(fā)現(xiàn)或研究項目是非常困難的。
Dr. Angeloni：由于越來越多的miRNA標志物與不同疾病相關(guān)并在診斷中變得重要，因此從小樣本中檢測出更多miRNA標志物的需求正在增加。對于一些基于PCR的技術(shù)來說，很難區(qū)分可能因單個核苷酸而不同的miRNAs。此外，從各種體液(尿液、血清和其他體液)中分離出的高質(zhì)量RNA的數(shù)量可能過低，無法準確鑒定低濃度的miRNA。當(dāng)重要的miRNA標志物因單個核苷酸而異時，這些因素可能對某些診斷應(yīng)用造成嚴重限制。
3、miRNA研究工具和試劑如何改進？
Dr. Angeloni：由于miRNA表達模式的多樣性可能與一些癌癥和非癌癥疾病相關(guān)，在有限大小的樣本中檢測不同miRNA表達模式的技術(shù)變得越來越重要。此外，與其他疾病一樣，個體間標志物表達模式可能有所不同，為了研究和診斷的目的，分析不同個體間表達模式的差異需要使用新的分析技術(shù)和生物信息學(xué)分析工具。在這兩個領(lǐng)域，多路復(fù)用分析平臺和新的數(shù)據(jù)分析工具正在為這些挑戰(zhàn)提供解決方案。
4、microRNA最近被用于液體活檢的診斷。那么miRNA還有其他令人興奮的新應(yīng)用嗎?
Dr. Horejsh：我相信我們對miRNA生物學(xué)的認識還處于早期階段。正如我們已經(jīng)看到循環(huán)游離DNA [cfDNA]在腫瘤學(xué)研究中的興趣和用途不斷增加一樣，miRNA的重要性也將繼續(xù)增加。我期待更好地理解外泌體、蛋白質(zhì)、循環(huán)cfDNA和miRNA如何在疾病早期更廣泛地用于癌癥研究，從而朝著緩解或治愈的方向平衡發(fā)展。
Dr. Angeloni：隨著miRNA表達的變化或序列變異導(dǎo)致不同疾病的發(fā)展，這為新的治療靶點打開了大門。因此，miRNAs作為治療藥物的使用已經(jīng)得到了一些成功的測試。另一個令人興奮的方法是miRNA靶向藥物的開發(fā)。一些公司正在開發(fā)針對心血管疾病、一些傳染病、代謝性疾病、癌癥和一些其他非癌癥疾病的miRNA藥物。由于miRNA涉及廣泛的人類疾病，開發(fā)新的有效miRNA靶向治療策略具有廣闊的前景。
循環(huán)MicroRNAs作為生物標志物
miRNA分析技術(shù)的一個挑戰(zhàn)性且具有潛在價值的應(yīng)用是鑒定循環(huán)生物標志物。這種生物標志物可以在通過非侵入性手段獲得的患者樣品中尋找到，允許重復(fù)取樣以及疾病和治療監(jiān)測。 然而，正如Tewari博士在綜述中指出的那樣，“在考慮潛在的循環(huán)miRNA標志物時，對分析前和分析變量進行嚴格控制的必要性越來越受到關(guān)注?！?/p>
這種關(guān)注早在2012年的評論中就提到過，現(xiàn)在依然適用。為了解決這一問題，Tewari博士最近致力于促進液體活檢研究的可重復(fù)性，通過RNA測序來定量miRNA。
MicroRNA來源于pre-miRNA，其自身折疊形成一個包含小區(qū)域雙鏈RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過Dicer將環(huán)去除，留下兩個互補的RNA分子：隨從鏈和引導(dǎo)鏈（整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中）。引導(dǎo)鏈或miRNA可能附著在互補的mRNA上，在這種情況下，RISC的Argonaut蛋白會降解mRNA。miRNA還可以與互補的mRNA結(jié)合，抑制翻譯。因為它不需要依賴完美的互補性，一個miRNA可以沉默數(shù)百個基因。
“不同的人正在使用不同的方法對小RNA進行測序，有時會得到不同的結(jié)果，”Tewari博士說?！叭绻^續(xù)這樣下去，那么這個領(lǐng)域?qū)⒑茈y取得進展。”
正如《Nature Biotechnology》中所描述的那樣，Tewari博士研究團隊制備了相同的樣本，并將它們送往全國各地的九個實驗室進行分析。每個實驗室都使用多種測試方案對四個不同的樣本進行測序，包括1個血漿樣本和3個合成RNA樣本。這些實驗室總共測試了9種不同的測序方案，包括4種商用試劑盒和5種實驗室開發(fā)的方案。
研究設(shè)計概述
“方案和序列特異性偏差都被鑒定出來，包括降低小RNA-seq精確測量miRNA中腺嘌呤-肌苷編輯能力的偏差，”該文章的作者寫道?！拔覀儼l(fā)現(xiàn)通過文庫制備方法可以減輕這些偏差，這些方法包含了具有簡并堿基的適配器。”
“我們意識到，”主要研究作者Maria D. Giraldez博士說?！?strong>不僅不同的方法會產(chǎn)生不同的結(jié)果，而且在給定的方案中，任何微小的變化都會帶來重要的變異程度。為了比較實驗室之間的結(jié)果，關(guān)鍵是使用一種通用的、高度標準化的流程方案。”
根據(jù)該研究，不同的測序方法對單個標志物的豐度估計不同，而且往往不準確。該研究還表明，使用聯(lián)合實驗室開發(fā)的方法可以改善這些估算。最后，正如密歇根大學(xué)的新聞稿所指出的，當(dāng)使用RNA測序來比較不同樣本之間單個miRNA的相對量時，所有方法都能得到準確且可重復(fù)的估計值。
參考文獻：
[1] Pritchard C C, Cheng H H, Tewari M. MicroRNA profiling: approaches and considerations[J]. Nature Reviews Genetics, 2012, 13(5): 358.
[2] Giraldez M D, Spengler R M, Etheridge A, et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling[J]. Nature biotechnology, 2018.
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