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肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近90%的肺癌由吸煙導致。主要的肺癌類型包括：腺癌、鱗狀細胞癌、小細胞癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肺類腫瘤。盡管不同組織亞型的肺癌會攜帶一些相同的變異，但大部分基因組變異還是截然不同的。在本綜述中，我們探討了近年來與腺癌、鱗狀細胞癌和小細胞癌相關的基因組學分析以及它們在治療方面的應用。

基因組景觀

與吸煙相關的肺癌是少數(shù)幾個有高突變負荷的癌癥之一。在肺腺癌中，相較于非吸煙者，吸煙者更容易發(fā)生C->A的顛換。吸煙者肺部惡性組織樣本的全外顯子測序表明，不考慮組織學亞型，在100萬個堿基對中平均存在8-10個體細胞突變。在非吸煙的腺癌患者的樣本中，100萬個堿基對中大概有0.8-1個突變，突變率要明顯要低很多。大量的體細胞拷貝數(shù)變異和基因重排進一步說明了肺癌基因組的復雜性。如此高的突變負荷，對試圖發(fā)現(xiàn)新的低頻變異的研究人員帶來了特殊的挑戰(zhàn)，需要大量樣品（約3000）來得到一個完善的候選腫瘤基因集，以涵蓋吸煙者的肺癌患者中突變頻率大于2%的基因。

染色體變異和基因拷貝數(shù)變異

肺癌患者腫瘤樣本的拷貝數(shù)分析確定了不同亞型之間常見的一些變異和特定亞型腫瘤中的變異。比如，3號染色體的短臂上有一些抑癌基因，經(jīng)常在肺癌發(fā)展早期發(fā)生缺失，它們在肺癌的各種亞型中都有發(fā)生。在肺癌患者中比較常見的缺失基因座為CDKN2A。包含種系特異性致癌基因的染色體擴增區(qū)域通常具有組織特異性，比如在鱗狀細胞癌和小細胞癌中位于3號染色體的長臂上的SOX2, 在腺癌中位于14號染色體的長臂上的NKX2-1。在肺癌患者中，已經(jīng)報道了大量的體細胞拷貝數(shù)變異，包括致癌基因的擴增和腫瘤抑制基因的缺失，如Table1所示。

Table1.     肺腺癌，鱗狀細胞癌和小細胞癌的復發(fā)性分子改變

DNA單核苷酸改變、插入和缺失

二代測序使得單堿基的檢測具有較好的精確度。來自TCGA及其他機構(gòu)的研究人員報道了許多肺腺癌、鱗狀細胞癌和小細胞癌的基因組變異，如Table 1所示。在肺腺癌中最常見的突變致癌基因有：KRAS (33%)，EGFR (14%)，BRAF (10%)，PIK3CA (7%)和MET (7%)。涉及抑癌基因的突變有：TP53 (46%)，TK11 (17%)，EAP (17%)，NF1 (11%)，RB1(4%)和CDKN2A (4%)。約10%的肺腺癌攜帶染色質(zhì)修飾基因(SETD2, ARID1A, SMARCA4)和RNA剪接基因(RBM10、U2AF1)中的突變。TCGA的數(shù)據(jù)表明：在顛換率低的組，相較于其他突變，EGFR突變更為常見（在無吸煙史的人群中富集）；在顛換率高的組，TP53、KRAS、NF1、STK11和RBM10突變更為常見（在有吸煙史或目前在吸煙的人群中富集）。

盡管在肺腺癌和鱗狀細胞癌中存在一些共有的突變，如TP53和CDKN2A，然而鱗狀細胞癌的特征在于低頻的編碼受體絡氨酸激酶基因突變（RTK）和高頻的抑癌基因缺失，如 PTEN、NOTCH1、 RB1。CDKN2A通常發(fā)生純合缺失（29%），其次是甲基化（21%），失活突變（18%），跳過1β外顯子的剪接變異（4%）。

小細胞肺癌的特征在于一些基因的復發(fā)性失活突變：RB1、RBL1、RBL2、TP53和PTEN；RNA調(diào)控基因（XRN1）；編碼G蛋白伴隨受體信號分子的RGS7和FPR1基因；具有中心體調(diào)控功能的ASPM、ALMS1、PDE4DIP。在一項關于小細胞肺癌體細胞變異的研究中，對110個腫瘤樣本進行全基因測序，結(jié)果表明在13%的樣本中TP73的突變和重排導致了致癌基因被激活，1/4的樣本存在NOTCH家族基因失活突變。

表觀遺傳改變

通過表觀修飾，與肺癌相關的幾種抑癌基因被沉默。肺腺癌中已經(jīng)報道了染色質(zhì)修飾基因（SMARCA4,ARID1A, SETD2）中存在突變。一種肺腺癌亞型富集了SETD2突變和CDKN2A甲基化，被鑒定為CpG島高甲基化表型。在小細胞肺癌中，CREBBP和 EP300的突變影響了組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，甲基化轉(zhuǎn)移酶基因MLL中也存在突變。

轉(zhuǎn)錄組變異

腫瘤標本的轉(zhuǎn)錄組分析得到了一些重要的發(fā)現(xiàn)，包括：DNA序列改變對轉(zhuǎn)錄本的影響，剪接位點突變和基因融合。U2AF1基因調(diào)控3′剪接位點的選擇。3%的肺腺癌患者的U2AF1基因存在突變，它與許多基因的不適當剪接選擇相關。在肺腺癌中，剪接位點突變會導致MET癌基因跳過重要的區(qū)域并造成穩(wěn)定蛋白的持續(xù)激活。在肺腺癌中，涉及ALK，ROS，NTRK1，NRG1，F(xiàn)GFR4，ERBB4，BRAF和RET的融合事件和基因重排為治療干預提供了機會。肺鱗狀細胞癌的FGFR基因家族存在基因重排的現(xiàn)象已經(jīng)被報道，它有可能會被作為治療干預的對象。然而，在小細胞肺癌中報道的多數(shù)重排，包括轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾物、抑癌基因等目前還不能輕易的進行靶向治療。

通路變異

綜合分析全外數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，RTK–RAS–RAF通路的各種成分在肺腺癌中幾乎總是受到影響（76%）。磷酸化蛋白質(zhì)組學研究表明，在一些KRAS野生型腫瘤中，MAPK通路存在大量激活，這可能是因為RTK–RAS–RAF通路中存在尚未被發(fā)現(xiàn)的成員。影響肺腺癌的其他通路包括：細胞周期調(diào)節(jié)（64%），p53 (63%)，染色質(zhì)和RNA剪接因子(49%)，以及氧化應激反應（22%）(Fig1)。

Fig1.     肺癌中的主要通路改變

由于拷貝數(shù)的變化，在鱗狀細胞癌中與氧化應激反應和鱗狀細胞分化通路相關的基因受到了影響。近1/3的鱗狀細胞癌腫瘤樣本中存在NFE2L2或KEAP1突變。這兩種基因在細胞中對氧化損傷的反應中起重要作用，這可能是由與吸煙相關的細胞損傷造成的持續(xù)攻擊引起的。

細胞起源

氣道上皮細胞由多種細胞組成，異質(zhì)性非常高。不同位置的細胞類型及比例都各不相同。在近端氣道中，基底細胞、棒狀細胞、纖毛細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和杯狀細胞占主要部分，肺泡由I型和II型肺細胞組成。肺癌的最終組織學類型取決于原始細胞的特定分子特征、導致這些細胞里分化通路失調(diào)的變異以及該過程發(fā)生的細胞環(huán)境(Fig.2)?；谛∈竽Ｐ偷难芯勘砻?，氣道神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中TP53和RB1的缺失會造成小細胞肺癌。II型肺泡細胞、連接細胞和肺泡管中的棒狀細胞被證明是小鼠肺腺癌細胞的起源。II型肺泡細胞在I型和II型肺細胞的更新中起作用，該過程可以通過死亡的I型細胞誘導產(chǎn)生，并依賴于表皮生長因子受體(EGFR), RAS和轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)的信號轉(zhuǎn)導。盡管缺乏確鑿的功能證據(jù)，但是近端氣道的基底細胞被假定為鱗狀細胞癌的起源細胞?；谛∈蟮难芯靠梢赃M行譜系追蹤，但這在人類中是無法進行的。對腫瘤發(fā)生過程中不同階段腫瘤起始細胞進行全面的分子分析，將大大提高我們對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子過程的理解。

Fig2.     不同組織亞型肺癌的細胞起源及特征變異

實體腫瘤的基因組分析揭示了越來越多的分支進化證據(jù)，由多個不同亞克隆組成的腫瘤擁有共同的祖先，但在腫瘤進化的后期會發(fā)生一些變異。這樣的亞克隆可能混合在一個腫瘤樣品中，也可能在原發(fā)性腫瘤中區(qū)域隔離，這些亞克隆為腫瘤的適應性、選擇性和進化適應提供了基礎。

研究人員應用多區(qū)域、全外顯子測序?qū)?1個早期肺腺癌患者的樣本進行了測序 ^[1]。在每一個案例中，都發(fā)現(xiàn)了瘤內(nèi)異質(zhì)性和分支進化的證據(jù)。在21個與疾病相關的已知突變中，其中20個存在于每一個區(qū)域，表明對早期非小細胞肺癌中的單次取樣方法足以描繪這種疾病的驅(qū)動事件。作者還研究了腫瘤中亞克隆的數(shù)量和復發(fā)之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)在手術后21個月內(nèi)發(fā)生復發(fā)的患者，其亞克隆突變的比例高于沒有復發(fā)的患者。然而我們還需要更多的前瞻性研究來證實這些結(jié)果。De Bruin和他的同事們通過多區(qū)域外顯子測序的方法研究了7個非小細胞肺癌，其中有5個腫瘤處于II期到IIIB期 ^[2]。在多個樣品里檢測到體細胞突變、拷貝數(shù)異質(zhì)性、基因組擴增事件發(fā)生在腫瘤進化早期，且這些事件出現(xiàn)在每個腫瘤區(qū)域的所有亞克隆，這些事件就是腫瘤進化樹的主干部分（Fig.3）。只在某一個區(qū)域出現(xiàn)的突變?yōu)榉种录?，這些突變的中位數(shù)比例為30%。對晚期腫瘤只進行單樣品分析時，有42%的概率會漏掉一些驅(qū)動突變。這些數(shù)據(jù)表明，單位點取樣漏掉驅(qū)動事件的風險可能隨著腫瘤的分期而增加。然而，我們還需要更多的研究去檢驗這一假設，例如英國TRACERx計劃等。

    Fig 3.     肺腺癌進化軌跡

 在肺腺癌中，與未戒煙的腫瘤患者相比，已戒煙的患者基因組發(fā)生C->A顛換的比例有所減少，表明某些突變過程在腫瘤進化后期貢獻主要致癌作用，削弱吸煙的致癌作用。與觀測結(jié)果一致，亞克隆突變在TpC位點富集了C->T和 C->G突變，這是APOBEC胞嘧啶脫氨酶蛋白家族的突變過程的特征。抗病毒酶APOBEC家族提供了重要的天然免疫防御，并且能讓病毒DNA或RNA產(chǎn)生突變，使其不能復制。APOBEC3B是癌癥的一個主要誘變源。在APOBEC的背景下，驅(qū)動基因上發(fā)生的突變通常屬于亞克隆突變，促進了腫瘤的多樣性和分支進化——該發(fā)現(xiàn)與APOBEC突變過程的重要性一致。也有證據(jù)表明，細胞毒性藥物如鉑類藥物用于治療非小細胞肺癌，也許也會留下亞克隆突變的足跡。隨著基因組測序數(shù)量的增加，發(fā)現(xiàn)基因組內(nèi)新的環(huán)境和內(nèi)源性突變過程的能力將增加，從而揭示驅(qū)動突變累積和分支進化的突變過程。

小鼠研究也揭示了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性驅(qū)動的小細胞肺癌擴散轉(zhuǎn)移的復雜性，以及原發(fā)癌－多克?。D(zhuǎn)移癌，和轉(zhuǎn)移定殖的亞克隆基礎。在極少的情況下，由EGFR突變引起肺腺癌在轉(zhuǎn)化為小細胞肺癌的過程中，伴隨著抑癌基因RB1的丟失。

確定治療的靶標分子

   攜帶EGFR變異的肺腺癌的治療已經(jīng)取得了重大的進展。與鉑類藥物化療相比，攜帶EGFR激活突變的轉(zhuǎn)移癌患者在使用了特異性EGFR激酶抑制劑后，會有顯著更高的反應率和無惡化生存期。腫瘤細胞發(fā)生ALK重排的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者使用ALK抑制劑后也有類似的結(jié)果。特異性激酶抑制劑也被用于包括ROS1、RET和BRAF分子靶標的研究中。肺癌突變聯(lián)盟已經(jīng)報道了攜帶明確定義分子改變的患者在使用分子靶向治療后，相較于腫瘤組織中沒有這樣靶標的患者，有更好的治療效果。這也突出了識別腫瘤細胞中致病變異的重要性。目前，基于一些癌癥基因的二代測序正在越來越多的用于臨床。在國家癌癥研究所資助的一個大型研究Lung-MAP中，研究人員正在通過使用基于二代測序技術的多基因芯片來探索靶向治療對鱗狀細胞癌患者的可用性。在英國進行的National Lung Matrix Trial 也涵蓋了非小細胞癌患者中靶向治療應用，該實驗根據(jù)個體或遺傳標志物組合劃分了21個組。

肺癌克隆進化的意義

肺腺癌和其它實體瘤的研究表明，在治療過程中，某些新出現(xiàn)或者已有的亞克隆具有進化選擇優(yōu)勢，使腫瘤細胞更適應藥物選擇壓力。中性進化也可能發(fā)生在非小細胞肺癌中，它會進一步增加選擇作用的底物的多態(tài)性。大量的肺癌相關的基因組學研究使用的樣本是從還沒有接受過任何系統(tǒng)性治療的患者中采集的。獲取疾病發(fā)展過程中樣本是非常重要的，這有助于在系統(tǒng)治療后全面了解克隆進化。隨著測序和腫瘤取樣方法的改善，研究人員正在記錄肺腺癌靶向治療的多種抗藥機制。這些數(shù)據(jù)表明，未來藥物發(fā)展策略中應考慮克隆進化和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的體細胞事件。

免疫治療反應的預測

研究人員正在努力確定針對晚期非小細胞癌中PD1受體的藥物反應的生物標志。Rizvi及其同事表明，抗PD1治療的反應與吸煙特征及非同義突變負荷有關。此外，腫瘤消退與CD8+ T細胞的新抗原特異性反應相關，這表明基于腫瘤的基因組特征進行選擇性和針對性的免疫治療是有潛力的。

循環(huán)腫瘤標志物的潛在用途

通過液體活檢技術獲取的ctDNA可以用于檢測早期和晚期癌癥里的體細胞變異及拷貝數(shù)變異?？汕谐姆切〖毎伟┗颊叩难獫{中cfDNA濃度高于健康人或慢性呼吸道炎癥患者。該技術可用于跟蹤隨著時間推移的腫瘤基因組進化，還能檢測靶向用藥位點及監(jiān)控有抗性的亞克隆，避免了多次活檢取樣。循環(huán)腫瘤細胞在小鼠中的研究為新藥物的開發(fā)提供了一定的支持，尤其是在小細胞肺癌中，腫瘤材料的獲得通常受到限制。

近5年的研究已經(jīng)揭示了肺癌發(fā)生的早期體細胞事件。隨著測序方法敏感度的不斷提高，通過cfDNA分析檢測早期肺腺癌和鱗狀細胞癌的能力得到提升，該技術可以作為放射學篩查的補充方法。我們在識別生物標志物方面已經(jīng)取得了重大進展，但是在預測患者術后是否復發(fā)方面還比較欠缺。此外，我們對晚期疾病的轉(zhuǎn)移過程和生物學特征知之甚少，應加強對尸體解剖的研究，以進一步了解晚期癌癥轉(zhuǎn)移過程。有證據(jù)表明，腫瘤發(fā)展的亞克隆與癌轉(zhuǎn)移的亞克隆之間的相互依賴關系可能會產(chǎn)生新的治療方法。

與生態(tài)演化類似，癌癥的進化是一個受限制的過程，其進程可能受到宿主基因組、腫瘤進化的前期步驟以及腫瘤的微環(huán)境的影響。更深入的理解肺癌進化的空間和時間動態(tài)可能會產(chǎn)生新的治療方法，以阻止腫瘤的進化。應對這些挑戰(zhàn)時，需要充分了解肺癌在術后的時間、空間上，及在面臨環(huán)境、藥物及免疫選擇的壓力下的進化。許多研究正在努力解決這些問題，例如在TRACERx的研究中，研究人員正在利用不同空間和時間節(jié)點腫瘤取樣的方法，以提升他們對循環(huán)生物標志物的理解。

隨著深度測序變得越來越普遍，在臨床護理中，信息學和臨床基因組數(shù)據(jù)分析的進展非常重要，這些進展必須提供實時反饋：在患者和醫(yī)生負擔得起的前提下，將最新的、可用的基因組學研究成果應用于臨床?；蚪M研究中使用的知情同意書應向患者介紹與基因組檢測相關的風險，包括隱私的泄露，及試驗可能會偶然檢測出與某些可能發(fā)生的特定疾病相關的種系有害突變。與基因組研究相關的知情同意書應給予患者是否愿意被告知偶然發(fā)現(xiàn)的選擇權。

另外，關于治療方法的研究仍然任重道遠。比如，制定靶向KRAS突變的策略時，應當首先研究肺腺癌中最常見的驅(qū)動致癌基因。制定利用協(xié)同致死的治療策略的是一個研究熱點：某兩種或更多的基因產(chǎn)物的破壞可導致細胞死亡，但單獨抑制其中任何一種都是無效的。協(xié)同致死的概念往往與相對棘手的治療靶點（如KRAS）相關。隨著我們對肺癌遺傳依賴關系的了解程度的提升，肺癌的缺陷可能暗示著新的治療途徑。

非小細胞肺癌（包括鱗狀細胞癌和腺癌）的突變負荷可能是免疫治療的阿喀琉斯之踵。在決策治療方案的順序時，可能需要考慮誘變療法的醫(yī)源性影響，因為一些有細胞毒性的化療和放療可能會造成新的突變，這也會對免疫療法的作用產(chǎn)生影響。此外，目前預測腫瘤新抗原發(fā)展的方法仍不成熟，僅限于MHC I類。對MHC I類和II類限制性新抗原的理解的提升可以幫助我們更好的了解腫瘤進化過程中的免疫監(jiān)視。最后，理解疾病發(fā)展過程中免疫微環(huán)境影響癌癥基因的方式，及在多樣化的基因組景觀背景下，宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤新抗原的反應方式，可能提供一個改善肺癌患者生存結(jié)果的方向。

參考文獻：

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