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世界上沒有兩片相同的樹葉，對(duì)于多細(xì)胞生物而言，其細(xì)胞與細(xì)胞之間也存在著差異，且不同群體細(xì)胞間的差異不一。這種差異不僅體現(xiàn)在形態(tài)上，也體現(xiàn)在遺傳信息上，例如基因組信息、基因表達(dá)水平等。雖然同一個(gè)體所有細(xì)胞均來自于同一個(gè)受精卵，理論上細(xì)胞間基因組是一致的，但是在細(xì)胞分裂和分化過程中，由于內(nèi)部隨機(jī)生物過程和外部環(huán)境擾動(dòng)的影響，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA序列發(fā)生改變，比較典型的例子是腫瘤細(xì)胞VS正常細(xì)胞、不同腫瘤細(xì)胞亞型（腫瘤異質(zhì)性）（圖1）。在基因表達(dá)層面上，不同的細(xì)胞也具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組，例如心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，而即便是那些看似相同的細(xì)胞集合，細(xì)胞之間的表達(dá)水平也存在巨大差異[1]。而細(xì)胞間遺傳物質(zhì)的差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異質(zhì)性。

圖1：腫瘤異質(zhì)性

人類基因組計(jì)劃（HGP）完成后，隨著測(cè)序技術(shù)尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對(duì)基因組變異/基因表達(dá)差異與表型之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)越來越深刻。然而傳統(tǒng)的Bulk 測(cè)序手段是針對(duì)細(xì)胞集合進(jìn)行測(cè)序，即所使用的材料是組織樣本或一大群培養(yǎng)細(xì)胞，針對(duì)這類樣本的研究反映的是特定組織/細(xì)胞集合的平均水平，或者是特定組織/細(xì)胞集合的代表性信息，而同一組織往往是由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，且單個(gè)細(xì)胞間表達(dá)的信息也千差萬別，因此常規(guī)Bulk 測(cè)序時(shí)單個(gè)細(xì)胞特異性的信息往往被掩蓋，導(dǎo)致錯(cuò)失很多重要信息。

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，常規(guī)Bulk 測(cè)序研究已經(jīng)不能滿足科研需求，2011年，《Nature Methods》將單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得期待的技術(shù)之一[2]；2013年1月，《Science》雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首[3]；2014年1月，《Nature Methods》將單細(xì)胞測(cè)序列為 2013 年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展，并且指出刊登在《Nature》系列雜志上的單細(xì)胞測(cè)序文章在2013年出現(xiàn)了大爆發(fā)[4]。因此單細(xì)胞測(cè)序正在成為科研熱點(diǎn)。

單細(xì)胞測(cè)序可以分為單細(xì)胞DNA測(cè)序（單細(xì)胞基因組測(cè)序）和單細(xì)胞RNA測(cè)序（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序），細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，1個(gè)細(xì)胞中含有的RNA只有1-10pg，這么少的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到現(xiàn)有測(cè)序儀的最低上樣需求，因此對(duì)于單細(xì)胞RNA測(cè)序，首先要解決的問題是RNA擴(kuò)增。

1990年，Norman Iscove課題組，使用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cDNA分子的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，首次證實(shí)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析是可行的[5]。

20世紀(jì)90年代初期，Eberwine等人發(fā)明了一種新技術(shù)，能夠從單個(gè)活神經(jīng)元細(xì)胞中獲得cDNA，并且再以這些cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA，實(shí)現(xiàn)RNA的線性擴(kuò)增[6]。

2008年發(fā)展出了高通量RNA測(cè)序技術(shù)（二代測(cè)序），隨后科研人員將高通量測(cè)序技術(shù)與之前發(fā)展起來的核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來，對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了更加精細(xì)的研究。最早出現(xiàn)的單細(xì)胞RNA擴(kuò)增方法結(jié)合二代測(cè)序方出現(xiàn)在2009年，即Tang’s method 。

Tang通過對(duì)單個(gè)小鼠卵裂細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，與芯片技術(shù)相比，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以多發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)情況[7]。之后，許多新穎的技術(shù)被開發(fā)出來，可以更快速、低成本地提供更多信息。Quartz-Seq實(shí)際上是對(duì)Tang的方法進(jìn)行了優(yōu)化，簡化了實(shí)驗(yàn)流程，進(jìn)一步減少了擴(kuò)增副產(chǎn)物的產(chǎn)生 [8]。CEL-seq技術(shù)于2012年發(fā)表在《Cell Reports》上，由以色列理工學(xué)院的研究人員開發(fā)[9]，CEL-seq是用體外轉(zhuǎn)錄代替PCR達(dá)到擴(kuò)增的目的。2014年《Science》雜志發(fā)布的MARS-seq[10]與CEL-seq很類似。Smart-Seq是一項(xiàng)具里程碑意義的技術(shù)，2012年由美國和瑞典的科學(xué)家共同開發(fā)。Smart-Seq [11]和Smart-Seq2 [12]是基于SMART技術(shù)（Switching Mechanism at 5′ End of RNA Template）對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，而且已經(jīng)有了較為成熟的商品化試劑盒，是目前應(yīng)用較多的手段。

隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序應(yīng)用的深入和細(xì)化，常常需要對(duì)復(fù)雜器官開展單細(xì)胞測(cè)序，單純對(duì)幾個(gè)細(xì)胞做測(cè)序不再滿足科研需求，需要一次性對(duì)幾千甚至幾萬個(gè)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，分析細(xì)胞間的基因表達(dá)差異，因此需要開發(fā)大規(guī)模低成本的單細(xì)胞測(cè)序方法。于是哈佛大學(xué)兩個(gè)團(tuán)隊(duì)將微流體技術(shù)與單細(xì)胞RNA-Seq結(jié)合，分別開發(fā)出Drop-seq[13]和inDROP[14]兩種技術(shù)，并在2015年發(fā)表在同一期的《Cell》雜志上。這兩種技術(shù)都利用微流體裝置生成液滴，液滴沿著一根極細(xì)槽道流動(dòng)時(shí)將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起包裹進(jìn)液滴，在液滴中實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增建庫，同時(shí)每個(gè)條形碼附著到每個(gè)細(xì)胞的基因上，因此可以一次測(cè)定所有的基因并追蹤每個(gè)基因的來源細(xì)胞。這些技術(shù)的出現(xiàn)，讓快速、低成本地分析數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的基因活性成為現(xiàn)實(shí)。

表1：單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)總覽[15]

隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的持續(xù)火熱，目前出現(xiàn)了一些大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，可以快速、大量的制備單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫并用于下游測(cè)序。目前主要的平臺(tái)包括：10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、BD Rhapsody? Single-Cell Analysis System、C1? 單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)、Illumina? Bio-Rad? Single-Cell Sequencing Solution、ICELL8 Single-Cell System等。

10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution由10x genomic公司于2016年2月推出，可實(shí)現(xiàn)大量細(xì)胞的快速高效標(biāo)記、測(cè)序和分析，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜和差異情況，并通過對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群體進(jìn)行深入細(xì)致分析，繪制大規(guī)模單細(xì)胞表達(dá)圖譜。

該平臺(tái)技術(shù)原理類似于Drop-seq：10x genomics平臺(tái)首先利用微流控技術(shù)分選單個(gè)細(xì)胞，然后將帶有barcode和引物的凝膠珠以及單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中；在油滴中凝膠珠溶解釋放反轉(zhuǎn)錄oligo，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過SMART法獲得用于測(cè)序的帶barcode的cDNA；液體油層破壞后，cDNA進(jìn)行后續(xù)文庫構(gòu)建，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，10min內(nèi)自動(dòng)完成多至80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲。

BD Rhapsody?系統(tǒng)基于微流控技術(shù)，可自動(dòng)將細(xì)胞試劑和微珠以很高的精度裝入微孔中，確保微孔間的互串?dāng)_限制在最低限度。細(xì)胞懸液經(jīng)注入孔注入后自然沉降到孔底，隨后， Beads 以相同方式由注入孔注入，從而在單個(gè)反應(yīng)孔中捕獲其中的細(xì)胞。Beads 上的序列結(jié)構(gòu)與 10X Genomics 相似，可以捕獲到游離 mRNA 的 polyA 尾實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增、建庫，單次實(shí)驗(yàn)可制備100-10,000個(gè)單細(xì)胞文庫。該系統(tǒng)具有成像系統(tǒng)，在細(xì)胞捕獲后，可直觀的看到細(xì)胞捕獲數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)等信息。

2012年6月13日Fluidigm 在日本橫濱舉行的國際干細(xì)胞研究學(xué)會(huì) (ISSCR ) 上發(fā)布了C1? 單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)，C1 系統(tǒng)基于Fluidigm創(chuàng)新的微流體技術(shù)，能夠讓研究者們快速可靠地分離單個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行分析。C1 單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)包括：小型臺(tái)式C1單細(xì)胞制備主機(jī)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的自動(dòng)化分離、裂解和預(yù)擴(kuò)增；C1 單細(xì)胞制備芯片，捕獲并平行制備出96個(gè)單細(xì)胞；C1 單細(xì)胞制備試劑包，用于進(jìn)行細(xì)胞懸浮、裂解和純化的專用試劑包。

C1 系統(tǒng)的工作流程如下：首先通過移液操作，將溶液中的細(xì)胞樣品加在C1微流體芯片上， C1 系統(tǒng)在輸入的指令下會(huì)快速自動(dòng)分離出 96 個(gè)單細(xì)胞并分配到單個(gè)制備倉中；之后，研究員們可選擇一個(gè)內(nèi)控點(diǎn)驗(yàn)證捕獲細(xì)胞的數(shù)量、區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞以保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性；隨后，在芯片上進(jìn)行細(xì)胞裂解、RNA反轉(zhuǎn)錄及預(yù)擴(kuò)增，整個(gè)過程無需任何手動(dòng)的溶劑混合及樣品轉(zhuǎn)移操作。最后，預(yù)擴(kuò)增的cDNA 產(chǎn)物被收集出來，轉(zhuǎn)移到BioMark HD系統(tǒng)中再進(jìn)行定量 PCR 分析。

Illumina? Bio-Rad? Single-Cell Sequencing Solution于2017年1月17日在JP摩根健康大會(huì)上發(fā)布，可一次性檢測(cè)8個(gè)樣本，每個(gè)樣本獲得500~10,000個(gè)細(xì)胞，其劣勢(shì)是捕獲效率僅為3%，但是測(cè)序成本相對(duì)較低。

Wafergen公司開發(fā)ICELL8 Single-Cell System單細(xì)胞分選平臺(tái)并在2015年12月發(fā)布，該平臺(tái)檢測(cè)原理與 BD Rhapsody?系統(tǒng)一致，均是基于微流控芯片技術(shù)，平臺(tái)每次運(yùn)行可分離500-1000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞捕獲效率為30%，成本相對(duì)較低。

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