專家介紹
李翀：現(xiàn)任西南大學藥學院教授、博士生導師、藥學系系主任。先后畢業(yè)于四川大學華西藥學院和復旦大學藥學院，分獲理學學士和博士學位；曾受國家留學基金委資助以聯(lián)合培養(yǎng)博士生身份在美國馬里蘭大學醫(yī)學院學習。主要圍繞靶向遞藥策略及其制劑轉(zhuǎn)化開展研究。先后主持國家自然科學基金、省部級研究課題及制藥企業(yè)研究課題10余項。以第一作者或通訊作者在JACS、Angew Chemie、Nano Letters等期刊上發(fā)表論文30余篇；擔任《藥學學報》（中、英文版）、《中國化學快報》青年編委。曾獲全國百篇優(yōu)秀博士學位論文獎和中國藥學會-中恒青年藥劑學獎。先后入選重慶市高等學校巴渝學者特聘教授和重慶市特支計劃青年拔尖人才。
正文
長循環(huán)納米制劑的構建策略及其相關研究進展
唐宜軒，李翀*
（西南大學藥學院，重慶 400715）
[ 摘要] 納米載藥系統(tǒng)承載著實現(xiàn)高效低毒治療的良好期望，但其體內(nèi)表現(xiàn)往往與體外研究結果差異顯著，所載藥物大多分布于富含巨噬細胞的肝、脾等臟器。這不僅限制了藥效的提升，同時也給肝、脾等帶來潛在的毒副作用。因此，延長體內(nèi)循環(huán)時間，減少非靶部位聚集對于納米制劑的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。綜述肝、脾等臟器對納米制劑遞藥進程的影響以及近年來長循環(huán)系統(tǒng)的設計與構建策略研究進展，以期為相關研究提供參考。
納米載藥系統(tǒng)如聚合物納米粒、脂質(zhì)體及膠束等因其對藥物的增溶及可增加穩(wěn)定性等作用而被廣泛運用于藥物的體內(nèi)遞送。同時，借助于病灶部位的病理生理特點，如腫瘤、炎癥部位的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）或病變細胞表達的特定受體，納米制劑能獲得被動或主動靶向性能，從而進一步提高藥物的療效。
在實際研究中，修飾有靶向配體的納米制劑雖然在體外細胞實驗中往往表現(xiàn)出良好藥效，但在體內(nèi)遞送中藥物總量的30% ~ 99% 會被含有網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）的肝、脾代謝。因此，受制于藥物與靶部位或靶細胞接觸的有效劑量與時間，納米制劑的治療往往難以達到理想的臨床療效，降低肝、脾的攝取及延長制劑半衰期則成為實現(xiàn)納米制劑的靶向遞送及提高藥物療效的先決條件。近年來，隨著研究者的積極探索，長循環(huán)制劑的構建已經(jīng)取得一系列進展。本文對納米載體在體內(nèi)遞送遭遇的障礙及目前主要的長循環(huán)載體構建策略的研究進展進行綜述。
1 納米載藥系統(tǒng)在體內(nèi)遭遇的阻礙與挑戰(zhàn)
從細胞水平而言，巨噬細胞廣泛分布于體內(nèi)各個組織中并發(fā)揮著清除衰老細胞及外來微粒的作用，巨噬細胞對入侵微粒的清除在保護機體安全的同時，也阻礙了納米藥物的高效遞送。從組織與臟器水平而言，肝臟對納米制劑發(fā)揮了主要的攝取與代謝功能，因此了解巨噬細胞及肝臟中其他細胞與納米藥物的相互作用，有助于采取合理的措施以減少納米制劑藥物損失，提高藥物的療效。
1.1 巨噬細胞對納米載體的識別與清除
巨噬細胞對納米載體的識別主要由兩方面因素介導：1）巨噬細胞本身存在納米載體的受體；2）納米載體在體內(nèi)遞送時，逐漸吸附血清蛋白，并受到調(diào)理作用的影響，這增強了巨噬細胞的識別作用。
1.1.1 巨噬細胞表面的受體影響
巨噬細胞表面存在多種受體，這些受體能夠識別相應的配體。因此，如果納米載體中含有該種配體，就會增強巨噬細胞對載體的識別和吞噬代謝，縮短載體在體內(nèi)的半衰期并降低藥物的療效。清道夫受體（scavenger receptor，SR）是存在于巨噬細胞表面的一組異質(zhì)性分子，其能識別乙?；鞍?、多聚陰離子大分子、細菌多糖、金納米粒及二氧化硅等。SR 一般分為6 類， 其中SR-A、SR-B及SR-D 被認為對納米制劑發(fā)揮了主要的識別作用。SR-A 是僅表達于巨噬細胞表面的一種三聚體跨膜蛋白[ 包括SR-AⅠ、SR-AⅡ及膠原結構樣巨噬細胞受體（macrophage receptor with collagenousstructure，MACRO）]，SR-AⅠ及SR-AⅡ存在于膜外層的膠原蛋白三螺旋區(qū)間，且有對低密度脂蛋白及部分微生物配體的識別區(qū)域，而MACRO 具有識別完整的革蘭陰性菌的能力。SR-B 分布于巨噬細胞、血小板、脂肪細胞及部分內(nèi)皮細胞，其識別域能夠識別血小板反應蛋白、膠原、低密度脂蛋白及磷脂酰絲氨酸。SR-D 又被稱為巨噬唾液酸蛋白或CD68，其具有識別并氧化低密度脂蛋白和磷脂酰絲氨酸的功能。
此外，巨噬細胞表面還存在大量的半乳糖顆粒受體（galactose particle receptor，GPR）和甘露糖受體，因此，修飾有乳糖、半乳糖及甘露糖的納米載體也會被巨噬細胞特異性識別。
1.1.2 血清蛋白的吸附和調(diào)理作用的影響
血清蛋白的吸附與調(diào)理作用是介導納米載體被巨噬細胞識別與吞噬代謝的重要因素，納米載體上所吸附的蛋白會被巨噬細胞相應的受體所識別，主要為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）和補體蛋白。
Ig 是廣泛存在于體內(nèi)的抗體大分子，而常用的納米載體材料不是內(nèi)源性物質(zhì)，因此，如磷脂、膽固醇及聚乙二醇等在體內(nèi)遞送時往往會產(chǎn)生相應抗體，該抗體識別并結合于納米材料后，可增強巨噬細胞Fc 受體對納米材料的識別以及吞噬，同時Ig 的吸附作用也會增強載脂蛋白受體及補體受體系統(tǒng)對納米載體的作用。
補體是體內(nèi)介導免疫應答和炎癥反應的蛋白質(zhì)，大約有35 ~ 40 種，廣泛存在于人類及其他高等脊椎動物的血清及組織液中，并參與細菌及真菌的識別與清除。脂質(zhì)體、碳納米管、嵌段共聚物及聚苯乙烯納米粒等可以激發(fā)補體系統(tǒng)，誘發(fā)巨噬細胞補體受體的識別。納米制劑進入血液后，補體蛋白吸附于制劑表面，并通過一系列蛋白水解酶的作用激活補體C3 蛋白，被激活的補體C3 蛋白通過氨基、巰基或羥基的共價鍵吸附于納米載體表面，使其能夠被具有C3 蛋白受體的巨噬細胞捕獲并代謝。
1.2 肝臟其他細胞的相關作用
盡管巨噬細胞被認為是參與納米藥物體內(nèi)代謝的第一要素，但是肝臟的其他細胞也在納米制劑的代謝過程中發(fā)揮了重要作用。
肝竇內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）是沿肝血管血竇排列的具有較強胞飲能力的細胞，LSEC 缺乏其他細胞常見的典型基底膜，且含有大小為100 ~ 150 nm 的膜孔。LSEC 對納米制劑的清除主要通過受體介導的內(nèi)吞作用。與巨噬細胞類似，LSEC表面表達有甘露糖受體、Fc γ 受體、α-膠原受體及透明質(zhì)酸SR 等，這些受體能夠識別相應的納米材料，且相比于肝臟巨噬細胞（Kupffer 細胞），LSEC 更趨向于吞噬小型單分散顆粒。此外，相比于Kupffer 細胞，LSEC 能更好地識別陰離子化的白蛋白。
肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是分布于肝血竇內(nèi)的一種呈梭形或多邊形的細胞，主要具有分泌及維護胞外基質(zhì)的作用。HSC 的表面具有多種受體，如Ⅳ型膠原受體、甘露糖受體、類胰島素生長因子2型受體、血小板衍生生長因子受體β 及αVβ3 整合素等。因此，HSC 也參與了含以上受體配體的納米載體的內(nèi)吞作用。
2 克服納米制劑體內(nèi)遞送障礙的策略
如前所述，納米制劑在肝脾被攝取主要是受到巨噬細胞的吞噬作用。因此，納米制劑長循環(huán)構建的方式主要以減少巨噬細胞的攝取為主，具體方式主要通過2 類策略實現(xiàn)：1）通過對納米載體進行表面修飾，從而達到被動逃逸或主動隱形；2）通過靜脈注射有機或無機材料及藥物，使巨噬細胞吞噬能力預先達到飽和或被抑制，從而延長隨后注射的納米制劑的半衰期并提高靶部位的藥物攝取量（見圖1）。
2.1 被動逃逸
在納米載體表面修飾親水性長鏈被廣泛用于延長納米載體在體內(nèi)的循環(huán)時間，該種修飾主要存在2 種功能：1）減少血清蛋白在納米粒表面的吸附，從而降低巨噬細胞對納米粒的識別作用；2）表面覆蓋的親水性長鏈能夠降低巨噬細胞對納米制劑材料的識別。本文主要討論常規(guī)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的優(yōu)缺點及PEG 衍生出的其他表面修飾長鏈對藥物體內(nèi)長循環(huán)的影響。
PEG 是已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food andDrugAdministration，FDA）認證可作為食品、藥品及化妝品的載體。PEG 修飾是目前應用于納米制劑體內(nèi)長循環(huán)遞送最成功的策略，其修飾的阿霉素脂質(zhì)體是已經(jīng)應用于臨床的長循環(huán)制劑。PEG 自身具有較低的免疫原性及抗原性，因此，在納米載體表面修飾PEG 可以顯著減弱體內(nèi)天然抗體的識別。此外，PEG 作為親水性長鏈，在納米載體表面的修飾可以減少血清蛋白的吸附。Walkey 等通過在金納米粒表面修飾不同密度的PEG 研究發(fā)現(xiàn)，當修飾密度為每平方納米0 ~ 1.25個PEG 時，血清蛋白吸附密度（μg · cm-2）隨PEG 修飾密度的升高顯著降低；以小鼠類巨噬細胞系J774A.1考察不同PEG修飾密度的金納米粒的抗吞噬能力顯示，當修飾密度為每平方納米0 ~ 1.12 個PEG 時，J774A.1的攝取量從大于100 μg · mg-1 降至 5 μg · mg-1 以下。除了修飾密度以外，PEG 的鏈長對于延長納米粒的體內(nèi)循環(huán)時間也有重要影響。Dos Santos 等考察了PEG修飾鏈長對脂質(zhì)體在體外半衰期的影響，結果顯示：在PEG 修飾比例為2%（物質(zhì)的量比）的條件下，隨著PEG 相對分子質(zhì)量的增加，脂質(zhì)體藥動學參數(shù)的曲線下面積（area under curve，AUC）從30.8 μg · h · mL-1 提高至41.3 μg · h · mL-1；而當PEG 修飾比例增至5% 以后，脂質(zhì)體AUC 值的差異顯著縮小。此外，納米制劑往往通過在載體表面連接靶向配體來實現(xiàn)藥物的主動靶向能力，但蛋白冠（protein corona）的存在往往會阻礙配體的識別，其通過在PEG 末端交聯(lián)配體可以提高靶向配體與受體在體內(nèi)的識別能力。對PEG 的優(yōu)化一般是為了減少巨噬細胞對PEG修飾納米粒的識別與吞噬，而Zhou 等通過對已經(jīng)修飾在納米粒的PEG 末端繼續(xù)交聯(lián)PEG 形成拓撲結構的研究證實，形成的拓撲結構能夠顯著降低LSEC 對納米粒的攝取作用，且相比常規(guī)PEG 修飾納米粒，該拓撲結構將制劑的平均滯留時間（mean retentiontime，MRT）延長了約3 倍。
盡管PEG 在臨床應用中表現(xiàn)出巨大的潛力，但目前仍存在兩大問題需要予以克服：1）PEG 有加速血液清除（accelerated bloodclearance，ABC）的現(xiàn)象，作為外源性物質(zhì)PEG 在第1 次注射時，體內(nèi)會逐漸產(chǎn)生能夠識別PEG 的IgM，因此2 次注射后，PEG 修飾納米粒會快速與IgM 相互作用，然后加速巨噬細胞對PEG 的識別與代謝；2）目前的納米制劑為了同時實現(xiàn)長循環(huán)與靶向遞送，往往在PEG 末端修飾有靶向配體，但PEG 作為柔性長鏈，對納米制劑的修飾往往會降低配體部分的靶向親和力。Hennig 等通過細胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度分析血管緊張素受體與修飾在量子點（Qdots? 655 ITKTM amino PEG）上的氯沙坦的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，將氯沙坦修飾在PEG 上后，氯沙坦與血管緊張素受體的平衡解離常數(shù)（KD）從1.1 nmol · L-1升至630nmol · L-1。
面對常規(guī)PEG修飾的困境，研究人員篩選得到了一系列替代的修飾基團，如聚氨基酸、兩性離子聚合物、聚維酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）及多糖等。相比于PEG 修飾，聚氨基酸修飾因其能通過體內(nèi)酶降解，故在實現(xiàn)延長納米藥物半衰期的同時，不造成藥物在體內(nèi)累積。此外，Romberg 等采用聚羥乙基天冬氨酸對脂質(zhì)體進行修飾，證實了該修飾與PEG 相比，顯著降低了ABC 效應。兩性離子聚合物（如羧酸甜菜堿和硫代甜菜堿等）能夠顯著降低蛋白的非特異性吸附。Keefe 等通過在蛋白表面修飾聚羧酸甜菜堿，不僅顯著提高了蛋白的穩(wěn)定性，且完全保留了蛋白與基質(zhì)疏水層的相互作用，同時證實了聚羧酸甜菜堿的修飾可以保留配體與受體的親和性。Zhang 等利用聚羧酸甜菜堿制備了納米微凝膠，且發(fā)現(xiàn)隨著聚羧酸甜菜堿的交聯(lián)度從15% 降至2%，納米凝膠的體內(nèi)半衰期從9.1 h 延長至19.6 h，且脾臟的藥物累積量從35 μg · g-1 降至13 μg · g-1。Kierstead 等通過藥動學分析PVP 修飾和PEG 修飾所產(chǎn)生的ABC 效應區(qū)別，其中PEG 修飾在第1 次和第2 次注射時的消除半衰期分別為33.6 h 和1.66 h，而PVP 修飾的消除半衰期分別為20.7 h 和 19.7 h，證實PVP 修飾不會引發(fā)ABC 效應。另外，通過多糖的修飾，能夠在納米粒子的表面形成親水性的外殼，從而降低調(diào)理素的吸附，延長納米粒子的循環(huán)時間，如Fan 等利用葉酸殼聚糖聚合物（FA-CS）制備膠束，證實其在利用殼聚糖延長藥物循環(huán)時間的同時，增強了阿霉素的靶向釋放。
2.2 主動隱形
納米載體被吞噬代謝是基于巨噬細胞將其認為是入侵機體的異物顆粒，因此，借助存在于生物體內(nèi)的一些天然載體對制劑進行偽裝則成為實現(xiàn)藥物長循環(huán)的另一類方法。
2.2.1 細胞作為納米制劑的載體
利用活細胞不被吞噬細胞吞噬的特性，將其直接作為納米制劑的載體是延長納米制劑半衰期的有效手段。細胞直接運載納米制劑主要通過表面吸附、細胞內(nèi)吞后到達靶部位再實現(xiàn)藥物遞送等手段實現(xiàn)，而紅細胞是體內(nèi)細胞中相對容易得到且分離難度較小的細胞，因此對該細胞的研究較多。Anselmo 等研究證實，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA] 納米粒吸附在紅細胞表面后，在延長藥物半衰期的同時，顯著提高了制劑在肺部的含量。除了紅細胞外，巨噬細胞及中性粒細胞也是常用的細胞載體。Choi 等利用腫瘤相關巨噬細胞具有腫瘤靶向的特性，使其預先吞噬金納米粒，在細胞到達腫瘤部位后，通過光熱誘導金納米粒破壞腫瘤細胞膜來達到治療的目的。Xue 等借助腦部腫瘤手術后炎癥對中性粒細胞的招募行為，先將載有紫杉醇的陽離子脂質(zhì)體內(nèi)吞至中性粒細胞，在靶向至腦部后，借助炎癥因子帶來的中性粒細胞的構型轉(zhuǎn)變，從而實現(xiàn)載藥制劑的完全釋放。
2.2.2 細胞膜包裹實現(xiàn)長循環(huán)及靶向遞送
采用細胞膜包裹納米制劑是直接利用細胞作為載體的替代方法，在保留細胞膜于體內(nèi)自我識別的特性的同時，又可以實現(xiàn)納米制劑自身的高載藥量及靶向遞送。Hu 等將紅細胞膜包裹在PLGA 納米粒上，通過熒光標記證實紅細胞膜包裹可以明顯延長納米粒的體內(nèi)循環(huán)時間，并且顯著優(yōu)于常規(guī)PEG 修飾納米粒。另外，在延長藥物半衰期的同時，細胞膜包裹納米制劑也表現(xiàn)出一定主動靶向性。Cao 等將巨噬細胞膜包裹于脂質(zhì)體表面，在延長藥物半衰期的同時，借助細胞膜上表達的整合素α4β1 和4T1 細胞上表達的血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的親和性，實現(xiàn)了藥物的主動靶向。此外，相比于細胞運載，細胞膜包裹可以同時采用多種細胞膜以獲得多種特性。He 等采用白細胞細胞膜和腫瘤細胞細胞膜同時包裹脂質(zhì)體，并將其命名為Leutusome，其相比于單種細胞膜包裹或常規(guī)脂質(zhì)體，在延長體內(nèi)循環(huán)時間的同時，可顯著增加腫瘤部位的藥物累積。
2.2.3 多肽和蛋白的修飾實現(xiàn)納米制劑的主動隱形
活細胞裝載及細胞膜包裹是借助于細胞膜表面蛋白與體內(nèi)巨噬細胞的自我識別，而巨噬細胞對“自我與非我”的識別主要是基于哺乳動物細胞表面的CD47 蛋白與表達于巨噬細胞的信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatoryproteinα，SIRPα）之間的相互作用。因此，在納米制劑表面修飾CD47 蛋白能夠消除或降低巨噬細胞對納米制劑的吞噬代謝作用。Qie 等通過在聚苯乙烯微球表面修飾CD47 研究發(fā)現(xiàn)，M0、M1 及M2 型巨噬細胞對微球的吞噬量均顯著降低。Kim 等通過同時在納米載體表面修飾CD47 及細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體（anti-ICAM），發(fā)現(xiàn)其在降低巨噬細胞吞噬的同時對內(nèi)皮細胞的靶向能力也提高了約87%。Rodriguez 等通過計算機模擬及分子對接技術從CD47 上獲得了一段功能性多肽，并將其命名為Self 多肽，該段多肽具有類似CD47 的抗巨噬細胞吞噬效果，將該段多肽修飾在聚苯乙烯納米微球上后，其在體內(nèi)抵抗巨噬細胞吞噬的同時也增加了納米制劑在腫瘤部位的蓄積量。
2.3 對巨噬細胞吞噬活性的暫時抑制或飽和
雖然納米制劑在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除是基于多種因素的共同作用，但是巨噬細胞的吞噬清除作用仍被認為是其中最主要的方式，因此通過限制巨噬細胞的活性，暫時抑制或消除其吞噬能力能夠有效促進藥物的體內(nèi)遞送。
巨噬細胞的吞噬具有一定的飽和性，因此根據(jù)巨噬細胞表面的受體親和性，預先通過靜脈注射一些有機或無機材料，可以暫時飽和巨噬細胞的吞噬能力。Souhami 等采用預先注射右旋糖苷的方式對巨噬細胞的吞噬能力進行飽和，再分別注射以放射性元素標記的陰離子、陽離子及中性脂質(zhì)體，通過組織分布分析顯示，相比于非飽和組，飽和組脂質(zhì)體在肝脾的分布減少了1/3 ~ 1/2。Proffitt 等通過預先注射6- 氨基甘露糖修飾的脂質(zhì)體對RES 進行飽和，且顯著增加了放射性標記的載體在腫瘤的累積量。Liu 等通過對小鼠直接注射大劑量（376 mg · kg-1）的空白脂質(zhì)體對RES 進行飽和，使后續(xù)注射的三氟納米粒在腫瘤的累積量提高了2 ~ 3 倍。此外，對巨噬細胞的吞噬活性進行暫時抑制，也能有效地提升納米載體的體內(nèi)遞送。Wolfram 等的研究發(fā)現(xiàn)，以氯喹對Kupffer 細胞處理后能夠通過降低磷脂酰肌醇結合網(wǎng)格蛋白組裝蛋白（phosphatidylinositol-binding clathrinassembly protein,PICALM）的表達而抑制細胞的內(nèi)吞作用，對小鼠以60 mg · kg-1 連續(xù)尾靜脈給藥7 d 后，注射的脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積量增加了約1 倍。
通過對巨噬細胞吞噬功能的暫時飽和或抑制實現(xiàn)納米制劑的體內(nèi)長循環(huán)遞送的難點在于篩選出安全且能夠長時間作用的材料。在以上列舉的材料中，磷脂為常用藥用輔料，因此以磷脂作為膜材的脂質(zhì)體的安全性已得到充分確認。但是脂質(zhì)體較短的半衰期制約了其作用時長，因此通過對脂質(zhì)體進行合理的修飾，在不改變脂質(zhì)體體內(nèi)分布的同時延長脂質(zhì)體的體內(nèi)半衰期將會提高該策略的臨床應用價值。
3 納米制劑逃逸網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取的評價
構建載體長循環(huán)系統(tǒng)的目的是為了增加藥物在人體內(nèi)作用時的療效，但在進行藥理評價之前，對長循環(huán)體系進行合理分析有助于提高實驗成功率并減少后續(xù)實驗成本。目前，現(xiàn)代影像學技術的進步使納米制劑在體內(nèi)分布的實時在線分析成為可能。但是對納米制劑逃離能力的合理評估仍需要對藥動學、巨噬細胞攝取及影像學結果的分析進行有機結合，并根據(jù)實驗目的而選取適宜的模式動物。
3.1 藥動學分析
藥動學是用以判斷藥物體內(nèi)半衰期的關鍵數(shù)據(jù)，通過對血液藥物濃度的分析，可以直觀地探知藥物在體內(nèi)的滯留情況。但根據(jù)修飾方法的不同，藥動學分析方法需要分別進行相應的優(yōu)化。Hu 等采用紅細胞膜包裹PLGA 納米粒實現(xiàn)了藥物的體內(nèi)長循環(huán)，且證實細胞膜包裹納米的半衰期（39.6 h）顯著高于PEG 修飾的納米粒（15.8 h）。Rodriguez 等采用Self 多肽修飾來實現(xiàn)聚苯乙烯納米微球的體內(nèi)長循環(huán)遞藥，在IgG調(diào)理的情況下，分析了含配體納米微球相對于全部納米微球在血樣中的比值，建立指數(shù)方程得到Self 納米粒的指數(shù)倍增時間為33 min，這顯著少于PEG 修飾的納米粒的指數(shù)倍增時間（T ＞ 200 min），證實Self 納米粒是基于抗巨噬細胞吞噬清除作用而實現(xiàn)制劑的長循環(huán)功能。
3.2 肝脾對納米制劑的攝取
肝脾作為RES 的主要臟器，評估其對藥物的攝取能力有助于合理評價逃逸能力，藥物含量組織分布的傳統(tǒng)方法能夠精確地測定肝脾對藥物的攝取量，但該方法往往耗時較長，而借助于熒光標記，活體成像技術能夠?qū)χ苿┰隗w內(nèi)的分布情況進行實時快速的半定量評價。如He 等采用雙細胞膜包裹的Leutusome 來進行藥物遞送，在離體熒光成像中發(fā)現(xiàn)Leutusome 在肝脾的熒光強度顯著下降，但在腫瘤部位明顯增加。Tavares 等通過注射氯磷酸來延長納米制劑的半衰期，在離體成像中，200 nm 粒徑的納米粒在腫瘤部位攝取量顯著增加。但是在部分情況下，熒光成像結果并不能和制劑的實際組織分布情況完全等同。Rodriguez 等在活體成像中發(fā)現(xiàn)， Self納米粒在脾臟的熒光顯著強于空白納米粒，但在組織分布測定中Self 納米粒組脾臟的藥物含量顯著低于對照組，該結果證明Self 納米粒具有抗吞噬作用，且能夠延長納米粒的體內(nèi)循環(huán)時間。此外，核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術也可以用來對納米制劑的長循環(huán)功能進行評價，Liu 等以MRI 技術對三氟納米粒在血液、肝臟及腫瘤的攝取分別進行分析，證實空白脂質(zhì)體對肝臟的飽和作用能顯著增加納米粒在腫瘤的累積，同時確認該飽和方式能夠在空白脂質(zhì)體注射1 ~ 3.5 h后促進三氟納米粒的遞送。
3.3 納米制劑對巨噬細胞攝取的逃逸
由血清蛋白吸附介導的調(diào)理作用是納米制劑被巨噬細胞識別并攝取的重要因素。因此，對納米制劑血清蛋白吸附量及種類的分析可以作為評價納米制劑長循環(huán)能力的重要參考。Walkey 等研究發(fā)現(xiàn)，隨著PEG修飾密度的升高，血清蛋白吸附量和巨噬細胞對納米的攝取能力均顯著下降，證明兩者顯著相關。Sch?ttler 等以小鼠類巨噬細胞系RAW264.7 對PEG 及聚磷酸酯（PEEP）修飾的聚苯乙烯納米微球的抗吞噬能力進行評價，證實吸附有一定量凝集素的PEG 或PEEP 納米微球能夠顯著抵抗巨噬細胞的攝取，而常規(guī)聚苯乙烯納米微球則在表面吸附有大量纖維蛋白原及血清白蛋白。在體內(nèi)遞送中，巨噬細胞對納米制劑的吞噬作用往往只能通過間接方式進行判斷。Liang 等以紅細胞膜包裹PLGA 納米粒進行藥物遞送，分別和巨噬細胞及細胞膜進行共定位分析，證實細胞膜包裹納米粒減少了巨噬細胞對其攝取。Rodriguez 等對Self 納米粒和脾臟巨噬細胞進行熒光共定位分析，證實了Self 納米粒能夠抑制脾臟巨噬細胞的吞噬作用。
3.4 模式動物的選擇
在制劑長循環(huán)評價中，小鼠因為飼養(yǎng)簡單且目前已存在多種轉(zhuǎn)基因模型，可以進行多方位的評價，因此成為初步評價的首選動物。Rodriguez 等采用動物模型研究證實了基于人源CD47 蛋白得到的Self 多肽具有延長制劑半衰期的能力。與小鼠相比，在哺乳動物犬類身上獲得的體內(nèi)循環(huán)參數(shù)相比小鼠的結果更具有說服力。Wang 等以比格犬作為模型動物，分別分析了PEG 修飾的膠束、脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒及納米乳注射后對ABC 現(xiàn)象的影響，證實PEG 修飾脂質(zhì)體的毛刷結構具有顯著增強IgM 產(chǎn)生的能力。以嚙齒類動物和哺乳動物作為模型時，面對的問題是無法實時準確地監(jiān)測納米制劑的半衰期，而斑馬魚可以通過熒光顯微鏡直接觀測且可以對相關組織或細胞進行轉(zhuǎn)染標記，因此可以實現(xiàn)實時成像。Sieber 等采用斑馬魚作為模式動物，以熒光對不同電位及PEG 修飾脂質(zhì)體在斑馬魚體內(nèi)的代謝情況進行追蹤標記，證實不同脂質(zhì)體在斑馬魚熒光的代謝參數(shù)溢出因子（extravasation factor，EF）和大鼠藥動學參數(shù)的AUC 值的變化趨勢相近，因此斑馬魚可用來對不同納米制劑的體內(nèi)循環(huán)行為進行初步比較。
4 結語與展望
綜上所述，為了實現(xiàn)納米制劑高效遞藥，減少RES 的攝取并延長藥物的半衰期是其關鍵一步?；趯Π踩?、可控性、低成本等方面的考慮，以新型高分子輔料為基礎的納米制劑表面修飾仍將是構建長循環(huán)遞藥系統(tǒng)的首選策略。同時，為了構建合理高效的長循環(huán)納米制劑，相關基礎理論研究仍需不斷深入。例如，減少血清蛋白的吸附一度被認為是評價納米制劑在體內(nèi)長循環(huán)效果的重要條件，但近期的一項研究表明，在無血清蛋白吸附的情況下，PEG 修飾納米載體被巨噬細胞的攝取量反而增加，提示吸附某些種類的血清蛋白有助于納米制劑擺脫巨噬細胞的吞噬。
通過活細胞或細胞膜實現(xiàn)長循環(huán)載藥是目前的研究前沿。在該類策略下，納米制劑的遞送依賴于細胞/細胞膜的固有性質(zhì)。今后，通過基因或細胞工程技術對細胞進行定向改造，構建更為智能的仿生載體系統(tǒng)，有望進一步擴大該策略的應用潛力。此外，借助相關領域生物醫(yī)學基礎理論、高分子材料及仿生科技的快速發(fā)展，合理地協(xié)同多種策略也將顯著推動長循環(huán)納米制劑的快速發(fā)展。
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