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Figure 8 :The Cas9 null mutant has lostboth of its DNA cleavage domains while still retaining its ability to targetgenomic loci through gRNA:DNA interactions. By fusing effector domains to theCas9 null mutant, it is possible to activate gene expression (i.e. V964 orNF-kB), repress gene expression (i.e. KRBA domain), visualize genomic loci(i.e. EGFP), perform chromatin remodelling (i.e. TET proteins), and simplifychromatin immunopercipitation (through an antibody epitope tag)

一、轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)

2013年，齊等人將來自化膿性鏈球菌的Cas9的核酸酶結(jié)構(gòu)域（在HNH結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生H840A突變和在RuvC結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生D10A突變）進(jìn)行突變，以產(chǎn)生核酸酶缺陷的“dCas9”。這種“鈍化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在gRNA的指導(dǎo)下仍能以相同的精確度靶向和結(jié)合DNA。

dCas9蛋白可以與效應(yīng)器（如阻遏蛋白和激活劑結(jié)構(gòu)域）形成融合蛋白，這樣，dCas9可以將這些效應(yīng)器帶到啟動子區(qū)域、調(diào)控區(qū)域或編碼區(qū)域，對任何基因進(jìn)行精確定點(diǎn)調(diào)控而不造成DNA損傷?？捎糜谘芯哭D(zhuǎn)錄因子或輔助轉(zhuǎn)錄因子對特定基因的影響。

Figure 1： dCas9 as a modularsystem for attachment of transcriptional regulators. dCas9 can easily be fusedto effectors (either transcription activators or repressors) for targeted generegulation. Adapted from Figure 1a of Gilbert et al. (2013).

二、基因激活與抑制系統(tǒng)

1.dCas9系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因的激活或抑制

①.dCas9-SAM—CRISPR Cas9基因激活系統(tǒng)

在第一代dCas9-SAM系統(tǒng)中，dCas9與典型的轉(zhuǎn)錄激活因子如VP64（單純性皰疹病毒蛋白16的合成四聚體）或p65（參與許多細(xì)胞過程的轉(zhuǎn)錄因子）融合。這個(gè)系統(tǒng)可以在多種真核細(xì)胞的全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。

為了增強(qiáng)激活能力，開發(fā)了二代dCas9-SAM系統(tǒng)。該系統(tǒng)建立在基本的dCas9-VP64結(jié)構(gòu)上，但其中的sgRNA是經(jīng)修飾過的，可以募集額外的轉(zhuǎn)錄激活因子以達(dá)成協(xié)同激活作用。這種修飾的sgRNA包含了兩段可結(jié)合噬菌體MS2外殼蛋白二聚體的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 MS2蛋白與另外的活化劑如p65和人熱休克因子1（HSF1）融合，這使得每個(gè)dCas9分子可以募集13個(gè)活化分子（圖2a）。這個(gè)新的dCas9-SAM系統(tǒng)可以可靠地將基因表達(dá)從10倍增加到幾千倍（圖2b）。由于這個(gè)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)修飾的sgRNA，人們開發(fā)了第三代dCas9-SAM系統(tǒng)，也稱為dCas9-VPR系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，這大大簡化了設(shè)計(jì)過程。當(dāng)與sgRNA文庫結(jié)合使用時(shí)，該系統(tǒng)還能夠支持大規(guī)模的全基因組功能激活，使其成為研究生物學(xué)過程和途徑的有力工具。

dCas9-SAM系統(tǒng)是一種，在不改變內(nèi)源基因組的條件下，可以選擇性地上調(diào)特定靶基因表達(dá)的簡便方法。由于其強(qiáng)大的激活能力，該系統(tǒng)將成為跨越多種細(xì)胞類型的治療性干預(yù)、基因篩選工具。研究人員已經(jīng)開始利用dCas9-SAM系統(tǒng)激活HIV-1轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)休HIV-1前病毒休眠。

Figure 2： The dCas9-SAMtranscriptional activation system. a) The dCas9-SAM system is made up of adCas9 fused to the transcriptional activator, VP64. The accompanying sgRNA canalso be modified to contain two RNA aptamers for binding with MS2 coat proteinsthat are also fused to one p65 and one HSF1 transcription activator. Adaptedfrom Figure 1f of La Russa et al. (2015). b) A comparison of the activationefficiency of dCas9-VP64 by itself (yellow) as well as with the modified sgRNAsystem (green) in the activation of four different genes: HBG1, IL-1B, IL1R2,and ZFP42. Relative expression levels were quantified using qPCR, with foldchanges determined by comparing with GFP-transfected cells. Adapted from Figure1b of Konermann et al. (2015). c) The dCas9-VPR system is composed of anordered fusion of transcriptional activators VP64, p16, and RTA. This systemdoes not require a specially modified sgRNA to achieve the same activationcapability as the dCas9-SAM system. Adapted from Figure 1a of Chavez et al.(2016). d) A comparison of the activation performance of dCas9-VP64, dCas9-VPR,and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene.

2.dCas9-KRAB—CRISPRCas9基因抑制系統(tǒng)

單獨(dú)的dCas9與靶位點(diǎn)的結(jié)合在空間上可以干擾轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合，起到抑制靶向基因轉(zhuǎn)錄的作用，這一過程稱為CRISPRi（或CRISPR干擾）。這個(gè)簡單的CRISPRi系統(tǒng)可以高達(dá)1000倍抑制，有效敲低細(xì)胞中的基因表達(dá)。雖然這個(gè)系統(tǒng)在細(xì)菌，酵母和其他原核細(xì)胞中的表現(xiàn)相當(dāng)好，但它在抑制哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)方面效果較差。

因此我們開發(fā)了dCas9-KRAB系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，dCas9與Kox1的轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域KRAB（Krüppel-associated box）融合（圖3a）。這種增強(qiáng)的CRISPRi系統(tǒng)依靠KRAB募集各種各樣的組蛋白修飾因子，通過形成異染色質(zhì)的方式可逆地抑制基因表達(dá)。該系統(tǒng)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染期間可以高度特異性地使內(nèi)源性真核基因表達(dá)降低60-80％（圖3b）。此外，在HeLa細(xì)胞中，穩(wěn)定整合到基因啟動子區(qū)域的dCas9-KRAB可以使內(nèi)源性基因產(chǎn)生5-10倍的抑制作用，當(dāng)靶位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游50-100bp時(shí)可產(chǎn)生100倍的抑制效應(yīng)。 dCas9-KRAB對細(xì)胞生長沒有影響，使其成為無毒的基因沉默方法。

不同于其他經(jīng)典的基因沉默方法，如RNAi（一種通過降解細(xì)胞質(zhì)中mRNA來敲低基因表達(dá)的方法），dCas9-KRAB系統(tǒng)在DNA水平上提供可抑制。這使得高度特異性抑制非編碼RNA，miRNA，反義轉(zhuǎn)錄物和核定位的RNA成為可能。

Figure 3 ：The dCas9-KRABtranscriptional repression system. a) dCas9 can be fused to KRAB, atranscriptional repressor. Adapted from Shalem et al. (2015). b) A comparisonof relative CD71 expression levels in a dCas9 (blue) vs. a dCas9-KRAB (red)system targeted to CD71 using three different sgRNAs. Relative expressionlevels were determined from flow cytometry for CD71 protein expression. Adaptedfrom Figure 3c of Gilbert et al. (2013).

三、CRISPR-dCas9-表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)

表觀遺傳調(diào)節(jié)是往往是通過影響一段染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)起作用，比如將染色質(zhì)壓縮成緊密狀態(tài)（異染色質(zhì)），使基因難以轉(zhuǎn)錄，或者使染色質(zhì)打開以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。表觀遺傳調(diào)節(jié)包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、組蛋白磷酸化等等。

最近，人們將dCas9與表觀遺傳修飾酶融合在一起，形成dCas9表觀遺傳編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)成員如表1所示。

Table 1 - The dCas9 Epigenetics Toolbox

1.dcas9-組蛋白修飾

①.dCas9-p300表觀遺傳激活系統(tǒng)（組蛋白乙?；到y(tǒng)）

組蛋白乙?；亲顝?qiáng)大的基因表達(dá)增強(qiáng)子系統(tǒng)之一。dCas9-p300的開發(fā)，使得人們能夠直接改變靶標(biāo)基因附近的染色質(zhì)狀態(tài)。在這個(gè)系統(tǒng)中，人類E1A相關(guān)蛋白p300的催化核心與dCas9融合，這是組蛋白乙酰化的關(guān)鍵成分（圖4a）。當(dāng)靶向編碼區(qū)或啟動子區(qū)時(shí)，這個(gè)系統(tǒng)可成功誘導(dǎo)基因高表達(dá)。特別是，當(dāng)靶向啟動子或增強(qiáng)子時(shí)，基因表達(dá)可增強(qiáng)50至10,000倍（圖4b）。通過轉(zhuǎn)錄組分析評估得到，基因激活是高度特異性的。這表明該系統(tǒng)可以精確調(diào)控某段染色質(zhì)的變化。

dCas9-p300是一種簡單而獨(dú)特的工具，可用于研究調(diào)控元件和靶基因表達(dá)之間的復(fù)雜關(guān)系。

Figure 4： The dCas9-p300system for epigenetic activation. a) dCas9 fused to the core catalytic domainof p300 can acetylate target sites in the genome. Acetylation of the targetgene synergizes with the action of transcription factors and RNA Polymerase II,resulting in transcriptional upregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner etal. (2015). b) Comparison of relative expression levels of IL1RN when dCas9 byitself vs. dCas9 fused to the p300 catalytic core is targeted to the IL1RNpromoter. Relative expression levels determined by qRT-PCR. Adapted from Figure1c of Hilton et al. (2015).

②.dCas9-LSD1表觀遺傳抑制系統(tǒng)（組蛋白去甲基化系統(tǒng)）

dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系統(tǒng)的互補(bǔ)基因抑制系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，dCas9與賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（圖5a）。 Kearns等人在穩(wěn)定表達(dá)dCas9-LSD1的小鼠胚胎干細(xì)胞系中，設(shè)計(jì)Oct4基因的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)域的gRNA，Oct4基因被抑制。然而，當(dāng)dCas9-LSD1針對Oct4啟動子時(shí)，沒有觀察到效果。這使得dCas9-LSD1成為研究增強(qiáng)子調(diào)控活性的工具。這與其他系統(tǒng)如dCas9-KRAB（它們是更全面的基因表達(dá)控制器）互補(bǔ)。當(dāng)靶向上游增強(qiáng)子時(shí)，dCas9-LSD1也能夠使下游基因表達(dá)沉默（圖5b），而不破壞基因組結(jié)構(gòu)。

由于在增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與人類疾病相關(guān)的許多基因組區(qū)域，因此dCas9-LSD1以高度特異的方式功能性地靶向增強(qiáng)子元件的能力使其在定義增強(qiáng)子 - 基因關(guān)系方面具有無價(jià)之寶。當(dāng)與增強(qiáng)子靶向的sgRNA池組合使用時(shí)，該系統(tǒng)可以提供高通量的方式來鑒定與基因相關(guān)的所有增強(qiáng)子。

Figure 5：The dCas9-LSD1system for epigenetic repression. a) dCas9 fused to LSD1 can demethylate targetsites in the genome. Demethylation of the target gene results intranscriptional downregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner et al.(2015). b) The relative expression level of the TBX3 gene was assessed viaquantitative PCR analysis when the sgRNA of the dCas9-LSD1 system was fusedwith a distal enhancer vs. a promoter. sgRNAs specific to an unrelated genomicregion were used as controls. Adapted from Figure 1e of Kearns et al. (2015).

2.dCas9-DNA甲基化修飾

①.dCas9-Tet1-CD –dCas9-DNA去甲基化修飾系統(tǒng)

哺乳動物細(xì)胞中的靶向DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列內(nèi)胞嘧啶的第五個(gè)碳上。細(xì)胞發(fā)育，分化和腫瘤都可以通過DNA甲基化來調(diào)節(jié)，高甲基化與癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。使DNA甲基化易于調(diào)節(jié)的技術(shù)可以直接探索甲基化狀態(tài)和基因表達(dá)之間的功能關(guān)系，甚至可以開發(fā)治療疾病的療法。

dCas9-Tet1-CD是以這種方式編輯表觀基因組的新技術(shù)之一。該系統(tǒng)由與Tet1（十 - 十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶1）的催化結(jié)構(gòu)域（CD）融合dCas9組成，該酶觸發(fā)DNA去甲基化（圖6a）。伴隨的sgRNA也可以進(jìn)行修飾，使之包含一個(gè)MS2二聚體，每個(gè)二聚體再與兩個(gè)Tet1-CD模塊融合。有研究表明，該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染后4天后觀察到基因的激活（圖6b）。在不同的人和小鼠細(xì)胞系中，結(jié)合精確的sgRNA設(shè)計(jì)和控制該系統(tǒng)不同組分的比例，dCas9-Tet1-CD系統(tǒng)及其伴隨的MS2-Tet1-CD系統(tǒng)能夠在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脫靶效應(yīng)。

dCas9-Tet1-CD系統(tǒng)地靶向特異性將幫助科學(xué)家輕易地探索特定基因啟動子靶點(diǎn)甲基化對下游基因的影響。最近，dCas9-Tet1-CD系統(tǒng)結(jié)合常規(guī)sgRNA也被用于靶向BRCA1啟動子的表觀遺傳修飾，BRCA1是一種腫瘤抑制基因，其過度甲基化沉默與非家族性乳腺癌和卵巢癌相關(guān)[15] 。這樣的系統(tǒng)也可以用來恢復(fù)其他腫瘤抑制基因的功能活性。

Figure 6：The dCas9-TET1-CDsystem for targeted DNA demethylation. a) dCas9 is fused to the catalyticdomain of TET1 (TET1-CD). The accompanying sgRNA is additionally modified tocontain two RNA aptamers that recruit MS2 coat proteins, each fused to aTET1-CD. Adapted from Figure 1a of Xu et al. (2016). b) qRT-PCR was used toassess mRNA levels of RANKL gene expression using two sgRNAs designed to targetthe RANKL promoter region (-800 bp upstream of transcription start site).Adapted from Figure 2c of Xu et al. (2016).

②.dCas9-DNMT3A —dCas9-DNA甲基化修飾系統(tǒng)

與基于組蛋白的細(xì)胞表型控制不同，DNA甲基化對基因表達(dá)的作用更穩(wěn)定和長期?；?/span>dCas9的甲基化系統(tǒng)不僅具有跨物種能力，而且對CpG甲基化不敏感。

dCas9-DNMT3A是先前討論的dCas9-Tet1-CD系統(tǒng)的甲基化對應(yīng)物。由Vojta等開發(fā)，該系統(tǒng)是dCas9（通過靈活的Gly4Ser接頭）與DNMT3A的催化結(jié)構(gòu)域（一種能夠在體內(nèi)甲基化CpG位點(diǎn)的活性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）融合。這個(gè)dCas9-DNMT3A系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞中成功地誘導(dǎo)BACH2啟動子上游和下游的位點(diǎn)特異性CpG甲基化，最高濃度的甲基化活性（60％）位于PAM序列下游27bp處。當(dāng)針對IL6ST啟動子時(shí)，轉(zhuǎn)染后10天后兩種基因的表達(dá)水平均顯著降低。此外，通過dCas9-DNMT3A與sgRNA池結(jié)合同時(shí)靶向多個(gè)基因特異性位點(diǎn)導(dǎo)致甲基化的協(xié)同作用，將甲基化提高2倍，擴(kuò)大該系統(tǒng)的基因沉默能力。

自其發(fā)展以來，dCas9-DMNT3A也被用于多種癌癥相關(guān)的腫瘤抑制基因的啟動子的甲基化如（CDKN1A和2A啟動子甲基化）。該項(xiàng)研究表明，CDKN1A啟動子的甲基化導(dǎo)致 CDKN1A的表達(dá)下降和細(xì)胞增殖能力的增加，進(jìn)一步證明了該系統(tǒng)用于功能基因組學(xué)研究。

Figure 7: The dCas9-DNMT3A system fortargeted DNA methylation. a) dCas9 is fused to the catalytic domain of DNMT3A.In vivo, DNMT3A recruits a partner for dimerization along with DNMT3L proteins(shown in dashed red box and ovals, respectively). Adapted from Figure 1a ofVojta et al. (2016). b) RT-qPCR analysis of IL6ST gene expression viadCas9-fused to active DMNT3A. Expression levels induced by dCas9 fused toinactive DMNT3A along with dCas9 accompanied by non-targeting sgRNAs weremeasured as negative controls. Fold change is relative to mock-transfectedcells. Adapted from Figure 4a of Vojta et al. (2016).