研究的初衷及背景
隨著靶向治療、免疫治療等新興療法的出現(xiàn)，基于分子分型、免疫表型等生物標(biāo)志物檢測(cè)的個(gè)體化精準(zhǔn)治療，已成為改善肺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，晚期肺癌患者常常存在無法獲取腫瘤組織、腫瘤組織標(biāo)本不夠或腫瘤組織含量不符合檢測(cè)要求等問題，阻礙了下一步的精準(zhǔn)診斷及治療，其中復(fù)發(fā)患者或多線治療失敗患者尤甚。如何解決上述問題，為此類患者提供無創(chuàng)檢測(cè)方式，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療成為肺癌精準(zhǔn)診療研究的國際熱點(diǎn)，這也是本研究的出發(fā)點(diǎn)。
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院的王潔教授團(tuán)隊(duì)一直致力于通過液體活檢技術(shù)全面指導(dǎo)晚期肺癌患者的精準(zhǔn)治療。液體活檢因?yàn)槠錈o創(chuàng)性、方便性、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，對(duì)于腫瘤患者的診斷和治療具有很強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)Rizvi教授首次提出TMB是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）潛在的免疫治療生物標(biāo)志物時(shí)（Science.2015;348:124-128.），王潔教授團(tuán)隊(duì)就做出了能否通過外周血ctDNA檢測(cè)TMB（bTMB）指導(dǎo)肺癌免疫治療的設(shè)想。在當(dāng)時(shí)，TMB檢測(cè)理念剛提出不久，檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)尚為全外顯子組測(cè)序（WES）；由于WES對(duì)腫瘤組織標(biāo)本要求很高、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、費(fèi)用較高，臨床上難以普及，在液體活檢中的應(yīng)用更是遙不可及；考慮到上述因素，王潔教授團(tuán)隊(duì)認(rèn)為通過NGS panel檢測(cè)TMB/bTMB是可行的研究方向。同時(shí)，為了讓更多中國肺癌患者從精準(zhǔn)診療中獲益，王潔教授對(duì)研究不同階段的目標(biāo)及應(yīng)用方向作出以下前瞻性規(guī)劃。
構(gòu)建理論體系 探索NGS panel能否替代WES進(jìn)行TMB/bTMB檢測(cè)。
滿足臨床應(yīng)用 在理論可行的基礎(chǔ)上，NGS panel設(shè)計(jì)之初需要同時(shí)考慮臨床應(yīng)用（全面指導(dǎo)免疫、靶向等治療）及性價(jià)比（降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)）。
技術(shù)可行性 驗(yàn)證設(shè)計(jì)的NGS panel技術(shù)可靠性，對(duì)bTMB與嚴(yán)格配對(duì)的組織WES檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
臨床可靠性 最終驗(yàn)證NGS panel檢測(cè)的bTMB與免疫治療療效的相關(guān)性。
研究設(shè)計(jì)及結(jié)果
研究設(shè)計(jì)
理論模型 基于TCGA 9205例腫瘤標(biāo)本的WES數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)虛擬的NGS panel，確定panel的基因數(shù)、TMB算法和基因選擇的理論模型，最終設(shè)計(jì)NCC-GP150 Panel（National Cancer Center - Gene Panel 150）。
虛擬驗(yàn)證 通過TCGA數(shù)據(jù)虛擬驗(yàn)證NCC-GP150與國際上成熟的MSK-IMPACT及F1CDx等Panel進(jìn)行TMB計(jì)算性能比較；并采用NCC-GP150 Panel計(jì)算34例接受PD-1治療的晚期NSCLC患者的TMB及其與PFS的相關(guān)性。
技術(shù)驗(yàn)證 基于48例NSCLC配對(duì)的血液和組織標(biāo)本，計(jì)算NCC-GP150計(jì)算的bTMB與WES檢測(cè)TMB的相關(guān)性。
臨床評(píng)估 基于50例晚期NSCLC患者接受PD-1/PD-L1單藥治療前的血液樣本，評(píng)估NCC-GP150計(jì)算的bTMB與療效的相關(guān)性。
研究結(jié)果
研究隨機(jī)抽取10～700個(gè)基因形成虛擬panel（分別隨機(jī)抽取50次），發(fā)現(xiàn)當(dāng)包含的基因數(shù)≥150個(gè)時(shí)，Panel計(jì)算的TMB與WES計(jì)算的TMB有較好的相關(guān)性，且標(biāo)準(zhǔn)差顯著下降；當(dāng)納入同義突變時(shí)，panel計(jì)算的TMB與WES的相關(guān)性進(jìn)一步提高。同時(shí)，研究首次納入了能提高TMB計(jì)算性能的特定基因，例如DNA損傷修復(fù)通路相關(guān)基因(DDR)；這部分基因變異可能導(dǎo)致更高的TMB并與免疫治療療效相關(guān)；這部分研究成果于2018年8月31日先發(fā)表于《癌癥研究》（Cancer Research），為NGS panel的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。
基于上述結(jié)果，研究設(shè)計(jì)了包含150基因的NGS panel，將其命名為NCC-GP 150。在實(shí)體瘤中，研究通過虛擬驗(yàn)證比較了NCC-GP 150計(jì)算的TMB與隨機(jī)抽取150個(gè)基因生成的RGP （RAN，Randomly sampled panels）計(jì)算的TMB有更好的相關(guān)性（與WES計(jì)算的TMB相比），這一結(jié)果提示按照之前的理論納入的150個(gè)基因?qū)τ赥MB計(jì)算有更好的代表性。后續(xù)，研究通過與國際上獲得FDA批準(zhǔn)TMB檢測(cè)或者有相關(guān)研究的NGS panel進(jìn)行比較，結(jié)果提示NCC-GP 150與MSK-IMPACT（468基因）和F1CDx（324基因）計(jì)算TMB的性能相當(dāng)（分別為r2=0.96、r2=0.97、 r2=0.96）。在療效相關(guān)性虛擬驗(yàn)證（Riviz et al. cohort）中，NCC-GP150計(jì)算的TMB-H 與TMB-L相比，能有效區(qū)分NSCLC患者接受PD-1治療的療效，中位無進(jìn)展生存期（mPFS）14.5 個(gè)月對(duì)比5.2 個(gè)月（P=0.03）。在完成虛擬驗(yàn)證之后，研究納入嚴(yán)格配對(duì)的48例晚期NSCLC的外周血及腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證（滿足未經(jīng)治療，標(biāo)本間隔時(shí)間不超過14天）。NCC-GP 150計(jì)算的bTMB 與WES計(jì)算的TMB有較好的相關(guān)性；當(dāng)bTMB cutoff ≥6時(shí)，達(dá)到最佳約登指數(shù)（0.59，敏感性: 88%，特異性: 71%）。這一結(jié)果也與FM 2018年8月發(fā)表于《自然醫(yī)學(xué)》（Nature Medicine）的結(jié)果相當(dāng)(r=0.62對(duì)比r=0.64)。在最終的臨床驗(yàn)證環(huán)節(jié)，研究共納入50例接受PD-1/PD-L1單藥治療的晚期NSCLC患者（外周血采集時(shí)間為免疫治療前4周內(nèi)）。當(dāng)采用bTMB≥6定義為bTMB-H時(shí)，患者免疫治療的PFS及客觀緩解率（ORR）相比bTMB-L患者顯著改善（mPFS: NR 對(duì)比 2.9 個(gè)月, ORR: 39.3% 對(duì)比 9.1%），且治療響應(yīng)組的bTMB水平顯著高于未響應(yīng)組。這一差異在PD-1/PD-L1作為一線或二線治療的患者中更為顯著（ORR: 61.1% 對(duì)比6.7%）。
最終，研究因?yàn)槠鋭?chuàng)新性及設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性發(fā)表于JAMA Oncol。
體會(huì)與分享
開展此研究的初衷是希望將無創(chuàng)性分子分型指導(dǎo)下的精準(zhǔn)治療拓展至PD-1/PD-L1抑制劑治療，幫助更多的晚期肺癌患者從免疫治療中獲益。既往與免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效相關(guān)的預(yù)測(cè)指標(biāo)都需要獲取腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，這無疑將眾多無法接受活檢或者沒有再次活檢條件的患者拒之門外。本團(tuán)隊(duì)十五年如一日地耕耘于外周血無創(chuàng)活檢指導(dǎo)肺癌精準(zhǔn)治療領(lǐng)域，面對(duì)上述難題，團(tuán)隊(duì)再次迎難而上，希望建立基于外周血免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)體系。
研究之初，國際上尚無ctDNA檢測(cè)TMB（bTMB）的類似研究可供參考，原創(chuàng)性研究總會(huì)面臨很多質(zhì)疑與挑戰(zhàn)，而中國研究者提出原創(chuàng)性理念時(shí)尤甚。該研究在外審階段，國際上首項(xiàng)bTMB研究結(jié)果在Nature Medicine上率先發(fā)表，一位審稿專家認(rèn)為本研究樣本量過小，且因測(cè)算TMB/bTMB的基因panel已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，對(duì)研究的創(chuàng)新性提出質(zhì)疑。在王潔教授的帶領(lǐng)下，團(tuán)隊(duì)成員與合作者思路迪團(tuán)隊(duì)多次討論，通過深入細(xì)致的分析，引經(jīng)據(jù)典對(duì)專家提出的數(shù)十項(xiàng)問題逐一回復(fù)，糾正了其“偏見”及錯(cuò)誤之處，并補(bǔ)充了大量額外分析數(shù)據(jù)以回應(yīng)質(zhì)疑。
審稿過程令人痛并快樂著，讓人充滿期待，亦帶來了意外的收獲。目前bTMB研究對(duì)免疫治療總生存（OS）期的預(yù)測(cè)效能還有待改善。在回復(fù)審稿人問題的過程中，經(jīng)過深度思考和數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)了這一問題背后可能的生物學(xué)機(jī)制及解決方案，提出了更優(yōu)化的bTMB算法模型：LAF-bTMB。LAF-bTMB能很好地預(yù)測(cè)OS、PFS及ORR，包括預(yù)測(cè)組間療效（免疫對(duì)比化療）及免疫組內(nèi)獲益人群，這一結(jié)果在POPLAR、OAK及中國NSCLC人群中得到了驗(yàn)證，并在2019年美國癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）年會(huì)上以壁報(bào)形式進(jìn)行展示。相信這一研究結(jié)果經(jīng)前瞻性研究驗(yàn)證后，或可更好地幫助臨床醫(yī)生選擇適合免疫治療的肺癌患者。
總結(jié)
從本研究的設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果分析、文章撰寫、一波三折的審稿過程中，我們的團(tuán)隊(duì)學(xué)習(xí)了很多，亦感悟良多。首先，從多維度、多層面建立無創(chuàng)性的靶向和免疫治療預(yù)測(cè)體系，以促進(jìn)肺癌精準(zhǔn)化進(jìn)程，是我們始終不渝的追求，而一個(gè)優(yōu)秀科學(xué)問題的凝練需要博覽群書、厚積薄發(fā)、充分論證；其次，多學(xué)科、跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)的合作、彼此間的互相學(xué)習(xí)、致敬是實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)的基礎(chǔ)與保障；最后，在科學(xué)探索的路上，咬定青山、百折不饒的精神是決定成敗的關(guān)鍵。我們?nèi)栽诼飞?，今后將繼續(xù)腳踏實(shí)地、砥礪前行。
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王志杰 副主任醫(yī)師 腫瘤學(xué)博士
北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士研究生導(dǎo)師
CSCO非小細(xì)胞肺癌專家委員會(huì)委員
CSCO青年專家委員會(huì)委員
中國抗癌協(xié)會(huì)肺癌專委會(huì)青委 副主任委員
北京醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)勵(lì)基金會(huì)肺癌青年專家委員會(huì)副主任委員，內(nèi)科學(xué)組副組長(zhǎng)
中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤藥物臨床研究專委會(huì)青年委員
中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤綜合治療專委會(huì)青年委員
中國醫(yī)促會(huì)控?zé)熀头伟┓乐螌Ｎ瘯?huì)委員
國家自然科學(xué)基金評(píng)審專家
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段建春 副主任醫(yī)師 腫瘤學(xué)博士
碩士研究生導(dǎo)師
CSCO非小細(xì)胞肺癌專家委員會(huì)委員
CSCO肉瘤專家委員會(huì)委員
北京醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)青年委員會(huì)委員
教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”骨干成員
獲2015年北京市優(yōu)秀人才計(jì)劃“青年骨干”項(xiàng)目資助
作者 | 王志杰 段建春（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院）
編輯 | 郝冉（中國醫(yī)學(xué)論壇報(bào)）
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