3. 序列變異解讀的擬定標(biāo)準(zhǔn) 以下評估變異證據(jù)的方法是用了解釋在臨床診斷實驗室中具有疑似遺傳(主要指孟德爾遺傳)疾病患者的變異. 并不適用于解讀體細胞變異、藥物基因組(PGx)變異、或者是多基因非孟德爾復(fù)雜疾病相關(guān)的基因變異. 在外顯子組或基因組研究中, 對候選基 因(意義不明確的基因(GUS))應(yīng)用這些準(zhǔn)則時應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎(見下面注意事項), 因為本指南目的不是滿足鑒定新致病基因的研究需求.
雖然這些方法可用于評估在健康個體中發(fā)現(xiàn)的變異或與測試指征不相關(guān)的變異, 但是正如在指南的幾個部分中所述, 對于與指征無關(guān)的有較低先驗致病性的變異時需更加謹(jǐn)慎. 盡管期望本指南適用于變異分類, 無論其是通過分析單基因、基因包、外顯子組、基因組或者轉(zhuǎn)錄組而鑒定的, 重要的是要關(guān)注與疾病有關(guān)的致病變異和雖然預(yù)測為對蛋白有破壞/損傷但卻與疾病無充分關(guān)聯(lián)的變異之間的區(qū)別.這些規(guī)則旨在確定在孟德爾遺傳病中有明確作用的基因的變異是否對該遺傳疾病是致病的. 針對具體的病人, 致病性判定應(yīng)該獨立于對疾病病因的解讀. 例如, 某變異在一個案例中被評估為“致病的”, 而在另一個案例中, 由于不能解釋該疾病, 就對這個位點不給出“致病的”評價, 這樣的情況是絕對不允許的. 確定致病性需要將全部的證據(jù)匯集在一起, 包括所有的案例分析, 最終得出一個結(jié)論.
此指南的分類方法可能比目前實驗室應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格. 這將導(dǎo)致很大一部分的變異被歸類為“意義不明確的”. 希望這種方法可以大量減少那些沒有足夠分類證據(jù)支持而報告為致病原因的變異 . 需要注意的是, 當(dāng)臨床實驗室報告一個變異為“致病 的”時, 醫(yī)療單位很可能把其當(dāng)作“可指導(dǎo)臨床作為 的(actionable)”, 基于這個判斷, 從而會改變對患者的治療、監(jiān)測，或去除對基因型為陰性的家庭成員的治療、監(jiān)測(參見下面的醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)該如何使用 這些指南和建議).
本指南提供了兩套標(biāo)準(zhǔn): 一是用于對致病或可能致病的變異進行分類(表 3), 另一是用于對良性或可能良性的變異進行分類(表 4). 致病變異標(biāo)準(zhǔn)可分為非常強(very strong, PVS1), 強(strong, PS1~4); 中等 (moderate, PM1~6), 或輔助證據(jù) (s upport i ng, PP1~5). 良性變異證據(jù)可分為獨立(stand-alone, BA1), 強(strong, BS1~4), 或輔助證據(jù)(BP1~6). 其中, 數(shù)字只是作為有助于參考的分類標(biāo)注, 不具有任何意義. 每個類別中的數(shù)字不表示分類的任何差異, 僅用來標(biāo)記以幫助指代不同的規(guī)則. 對于一個給定的變異, 用戶基于觀察到的證據(jù)來選擇標(biāo)準(zhǔn). 根據(jù)表5的評分規(guī)則把標(biāo)準(zhǔn)組合起來進而從5級系統(tǒng)中選擇一個分類. 這些規(guī)則適用于變異上的所有可用數(shù)據(jù), 無論是基于調(diào)查現(xiàn)有案例獲得的數(shù)據(jù), 還是來源于先前公布的數(shù)據(jù). 未發(fā)表的數(shù)據(jù)也可以通過公共數(shù)據(jù)庫(如 ClinVar 或位點特異數(shù)據(jù)庫)和實驗室自有數(shù)據(jù)庫獲得. 為了對變異分類具有較好靈活性, 基于收集的證據(jù)和專業(yè)判斷, 可以把某些依據(jù)用到不同的證據(jù)水平上去. 例如, 如果一個變異多次和已知致病性變異處于反式位置(位于另一染色體上), PM3 可以上調(diào)到強(進一步指導(dǎo)見PM3 BP2順/反式檢測). 相反, 在數(shù) 據(jù)并不像描述的那么強的情況下, 可以改判變異到一個較低的水平(見表3注2 PS4). 如果一個變異不符合分類標(biāo)準(zhǔn)(致病的或良性的), 或良性和致病的證據(jù)是相互矛盾的, 則默認(rèn)該變異為“意義不確定的”. 程度判斷評價標(biāo)準(zhǔn)如表6所示. 請注意, 當(dāng)考慮所有 依據(jù)以解讀變異證據(jù)強度的差異時, 需專家介入進行判斷.
下面更詳細的變異分類標(biāo)準(zhǔn)(表3和4)中提及了某些概念的解釋, 并提供實際使用中的實例和/或誤區(qū)或易犯錯誤的地方. 這部分應(yīng)該與表3及4一同閱讀.
3.1 PVS1極強致病性變異
某些特定類型的變異(如無義突變、移碼突變、經(jīng)典剪接位點±1或2點突變、起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失)被認(rèn)為因無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或由無義突變引起的轉(zhuǎn)錄子降解, 導(dǎo)致基因產(chǎn)物完全缺失而破壞基因功能. 當(dāng)將這類變異歸類為致病性時, 從業(yè)人員需謹(jǐn)慎考慮以下原則:
(i) 當(dāng)將該類變異歸類為致病性時, 需確認(rèn)無功能變異(null variants)是已知的致病機理, 且與該疾病的遺傳模式相一致. 例如, 有些基因(如許多肥厚性心肌病基因)只有雜合錯義突變時才致病, 而雜合無功能變異卻是良性的. 僅基于這一項證據(jù)來看, 對顯性肥厚性心肌病來說, MYH7基因上出現(xiàn)一個新的雜合無義突變不一定是致病的, 而 CFTR 基因上出現(xiàn)一個新的雜合無義突變則有可能是一個隱性致病變異.
(ii) 當(dāng)文獻中將 3′遠端下游截短變異注釋成致病突變時, 要特別小心. 特別是當(dāng)所預(yù)測的終止密碼子出現(xiàn)在最后一個外顯子, 或者出現(xiàn)在倒數(shù)第二個外顯子的最后50個堿基對時, 這種無義突變介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄降解可能不會發(fā)生, 這個蛋白很可能會表達.據(jù)此所預(yù)測的截短蛋白的長度也是致病性評估的因素, 但這些變異未經(jīng)功能分析是無法進行判定的.
(iii) 就剪接位點變異而言, 因外顯子剪切位點的供體/受體位點改變或產(chǎn)生了新的剪切位點, 從而可能導(dǎo)致外顯子丟失、縮短, 也可能會使內(nèi)含子序列變成外顯子部分. 雖然剪切位點變異可能被預(yù)測為無功能變異, 然而該變異類型造成的影響需要通過 RNA 或蛋白質(zhì)功能分析確認(rèn). 還必須考慮可讀框內(nèi)缺失/插入的可能性, 其長度變化較小(PM4),可以保留蛋白質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域, 因此導(dǎo)致輕微或中性效應(yīng), 或功能獲得效應(yīng).
(iv) 基因會有不同的轉(zhuǎn)錄本, 哪一種轉(zhuǎn)錄本與生物學(xué)功能相關(guān), 在哪些組織會表達哪些轉(zhuǎn)錄本, 這些都是需要進行重點考慮的. 如果一個截短變異只限于一個或并非所有轉(zhuǎn)錄本, 則必須謹(jǐn)慎考慮到可能存在其他同功型蛋白質(zhì), 防止過度解釋.
(v) 如果發(fā)現(xiàn)一個無功能變異位于某個外顯子上, 而該外顯子先前無致病變異報道, 那么該外顯子可能被選擇性剪切了, 此時需要謹(jǐn)慎考慮該變異的致病性. 當(dāng)預(yù)測的截短變異是偶然發(fā)現(xiàn)時(與檢測指征無關(guān))則應(yīng)特別小心, 在這種情況下該位點致病的可能性非常低.
3.2 PS1突變?yōu)橥话被?/span>
多數(shù)情況下, 尤其是當(dāng)致病機制是蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變時, 如已確定某一錯義變異是致病變異, 應(yīng)考慮到與其位于同一變異位點的不同形式的堿基改變也可能產(chǎn)生相同的錯義突變結(jié)果——氨基酸改變相同(如c.34G>C(p.Val12Leu)和c.34G>T(p.Val12Leu)), 那么, 這些變異也應(yīng)是致病突變. 此外, 還應(yīng)考慮到, 變異可能不是通過改變氨基酸的水平, 而是通過改變DNA的序列來發(fā)揮作用, 例如, 破壞剪接 位點(可通過軟件分析確定), 在這種情況下, 上述的假設(shè)是不成立的.
3.3 PS2 PM6新發(fā)變異
當(dāng)將一個新發(fā)變異(父母樣本檢測結(jié)果陰性)歸類為強的致病證據(jù)時, 需要滿足以下條件: (i) 身份檢驗表明患者的父母是其生物學(xué)父母. 注意如果父母的身份是假定的而沒有被證實, 則判定為PM6; (ii) 患者的家族史符合新發(fā)變異特征. 例如, 顯性遺傳病患者的父母均未患病. 在存在生殖細胞嵌合現(xiàn)象時也可能有1個以上同胞患病; (iii) 患者的表型與變異基因異常引起的表型相吻合. 例如, 患者具有特殊面容、多毛和上肢缺陷(即 Cornelia de Lange 綜合征), 檢測到NIPBL基因的新生突變即為強致病證據(jù), 而患者僅表現(xiàn)為非特異性的發(fā)育遲緩, 通過外顯子組測序發(fā)現(xiàn)的該基因的新發(fā)變異, 則判斷此變異致病性的證據(jù)較弱.
3.4 PS3 BS3功能研究
功能實驗研究是一種研究變異致病性的非常強大的工具, 然而并非所有的功能研究都能有效地預(yù)測基因或蛋白的功能. 例如, 一些酶學(xué)實驗利用成熟 完善的方法可以用來評估錯義變異在代謝途徑中對酶活性的影響(如 α-半乳糖苷酶功能實驗); 而另一方 面, 某些功能實驗在評估變異對蛋白質(zhì)功能的影響時缺乏一致性. 評估一個功能檢測方法是否有效時, 必須考慮該功能實驗在多大程度上反映了其發(fā)揮功能的生物環(huán)境. 例如, 與體外表達蛋白相比, 直接在患者或動物模型的活檢組織中進行酶的功能實驗更有說服力. 同樣, 可以反映蛋白質(zhì)全部生物學(xué)功能 (如酶分解底物功能)的實驗則比僅反映一部分功能 (如一種有附帶結(jié)合能力的蛋白水解 ATP 的功能)的實驗證據(jù)性更強. 功能實驗的有效性、重復(fù)性和穩(wěn)定性應(yīng)重點考慮, 這些參數(shù)用來評估功能實驗的分析 性能以及判定樣本診斷信息的完整性, 該完整性容易受標(biāo)本采集的方法及時間 、存儲及運輸?shù)挠绊?. CLIA(臨床實驗室改進修正案)認(rèn)證實驗室建立的檢測方法或商品化試劑盒可減少這些因素對實驗的影響. 評估變異在剪接位點、編碼序列、非翻譯區(qū)以及 更深的內(nèi)含子區(qū)域的影響時, 對變異在信使RNA水平(如信使 RNA 的穩(wěn)定性、加工或翻譯)進行評估, 可以提供豐富的信息. 相關(guān)的技術(shù)方法包括對 RNA 和/ 或互補DNA 衍生物進行直接分析, 以及體外微小基因剪接分析.
3.5 PS4 PM2 BA1 BS1 BS2 變異頻率及對照人群的使用
通過搜 索公共人群 數(shù)據(jù)庫(如千人基因組數(shù)據(jù) 庫, NHLBI 外顯子測序數(shù)據(jù)庫, EXAC 數(shù)據(jù)庫; 表 1), 并利用已發(fā)表文獻中相同種族的對照數(shù)據(jù)進行基因變異頻率分析(譯者注: 此條款在指南更新時會有修改), 通過分析變異基因在對照人群或普通人群中的攜帶頻率, 有助于評估該變異的潛在致病性. NHLBI 外顯子測序數(shù)據(jù)庫來源于白種人和非裔美國人群 , 根據(jù)其數(shù)據(jù)覆蓋量能夠識別是否存在基因變異. 盡管千人基因組數(shù)據(jù)庫缺乏評估基因變異能力, 但它囊括了更多的種族人群, 因此其數(shù)據(jù)具有更廣泛代表性的. EXAC數(shù)據(jù)庫近期發(fā)布了一組來源于不同人群的6萬多個外顯子組的等位基因頻率數(shù)據(jù), 包括了大約三分之二的 NHLBI 外顯子測序數(shù)據(jù). 一般情況下, 某一等位基因在對照人群的頻率大于疾病預(yù)期人群(表 7)時, 可認(rèn)為是罕見孟德爾疾病良性變異的 強證據(jù)(BS1), 如果頻率超過 5%時, 則可認(rèn)為是良性變異的獨立證據(jù)(BA1). 此外, 如果疾病發(fā)生在早期, 且變異在健康成人中以隱性(純合子)、顯性(雜合子) 或X-連鎖(半合子)的狀態(tài)存在, 那么這就是良性變異的強證據(jù)(BS2). 如果數(shù)據(jù)庫中未能檢出變異的存在, 應(yīng)該確認(rèn)建立該數(shù)據(jù)庫采用的測序讀長深度是否足以檢測出該位點上的變異. 如果在一個大樣本的普通人群或隊列數(shù)據(jù)的對照人群(>1000 人)中變異不存在(或隱性遺傳的突變頻率是低頻), 并且攜帶此變異的患者與對照人群為同一種族, 那么可以認(rèn)為該變異是致病性的中等證據(jù)(PM2). 許多良性變異是“個體化的”(即個人或家系獨有的), 因此即使在相同種族的人群中缺乏也不能作為致病性的充足甚至強的證據(jù).
當(dāng)孟德爾遺傳病表型顯著、頻率差異大且是早期發(fā)病時, 使用通過“病例－對照”人群研究獲得的變異數(shù)據(jù)庫進行變異分析是最有效的. 臨床實驗室檢測的患者可能包括“排除”某一疾病的個體, 因此他們可能不能作為表型顯著的病例; 當(dāng)使用普通人群作為對照群體時, 具有亞臨床疾病的個體總是可能存在的. 在這兩種情況下, 認(rèn)為檢測出的變異致病性證據(jù)不充分. 變異頻率有統(tǒng)計學(xué)顯著差異可以假定為致病性的支持證據(jù). 與此相反, 對于統(tǒng)計差異不顯著, 特別是極為罕見變異和不明顯的表型, 應(yīng)謹(jǐn)慎 解釋.
比值比(OR)或相對風(fēng)險用于衡量基因型(即存在于基因組中的變異)和表型(即所患疾病/結(jié)果)之間的關(guān)聯(lián), 適用于任何孟德爾疾病或復(fù)雜疾病. 本指南只涉及其在孟德爾疾病中的使用. 相對風(fēng)險與OR不同, 但概率較小時相對風(fēng)險近似等于OR. OR值為1.0 意味著該變異與疾病風(fēng)險不相關(guān), 大于 1.0 意味著變異與疾病風(fēng)險正相關(guān), 小于 1.0 意味著變異與疾病風(fēng)險負相關(guān). 一般情況下, 具有孟德爾中等效應(yīng)的變異, 其OR 值為 3 或者更大, 高度外顯的變異具有非常高的 OR 值, 例如, APOE 基因 E4/E4 純合子與E3/E3 純合子相比, OR值為 13(https://www.tgen.org/ home/education-outreach/past-summer-interns/2012-summer-interns/Erika-kollitz.aspx#.VOSi3C7G_vY)。OR值的置信區(qū)間(confidence interval, CI)也是一個重要的衡量工具. 如果 CI 中包括1.0(如 OR=2.5, CI= 0.9~7.4), 則關(guān)聯(lián)的可信度很小. 在上面APOE的例子中,CI為10~16. 在線可獲得簡單的OR值計算器(http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm/;http://easyca-lculateon.com/statistics/odds-ratio.php/).
本文整理自《中國科學(xué): 生命科學(xué)》雜志，侵刪
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