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Nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序在人類基因組測(cè)序方面主要優(yōu)勢(shì)集中于基因組組裝及結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方面。由于其堿基錯(cuò)誤率較高，其在臨床應(yīng)用所需的單核苷酸變異（SNV）檢測(cè)方面存在困難。

為了評(píng)估納米孔測(cè)序在臨床人類基因組學(xué)的應(yīng)用潛力，作者利用便攜式MinION三代測(cè)序儀測(cè)序了2個(gè)人類基因組：基因組參考樣本NA12878，增加其測(cè)序深度，以評(píng)估和校準(zhǔn)三代nanopore變異檢測(cè)方法；然后對(duì)伴有嚴(yán)重免疫失調(diào)的共濟(jì)失調(diào)性全血細(xì)胞減少綜合征患者進(jìn)行測(cè)序，以解決與分子遺傳學(xué)診斷相關(guān)的2種新生蛋白編碼變異的染色體定相（phasing）相關(guān)問題。

GM12878人B淋巴細(xì)胞采用PCR擴(kuò)增和6kb片段篩選的文庫制備方案，共計(jì)獲得45,740,123條reads（圖1a），平均讀取長(zhǎng)度為6373bp（圖1b）在流動(dòng)細(xì)胞中是一致的，并且基于測(cè)序文庫的物理大小選擇非常接近預(yù)期?？倲?shù)據(jù)量為273.4Gb，每個(gè)flow cell的平均產(chǎn)量為3.7Gb（圖1c）。總計(jì)42,924,782個(gè)高質(zhì)量clean reads的比對(duì)率為99.3％，唯一比對(duì)率為88.8％。

比對(duì)上的reads平均堿基替換SNV發(fā)生率為12.7％（與參考?jí)A基不同的頻率），平均缺失率為4.7％（參考序列中堿基缺失的頻率），平均插入率為3.2％（圖1d）。作者還評(píng)估了不同堿基識(shí)別算法對(duì)reads水平準(zhǔn)確性的影響，發(fā)現(xiàn)Albacore v2.0.2實(shí)現(xiàn)了最低的未過濾替換錯(cuò)誤率和缺失錯(cuò)誤率，而其他方法具有較低的插入錯(cuò)誤率。

平均每個(gè)堿基覆蓋深度（不包括缺失）為81.7X（圖1e），其中90.4％的基因組區(qū)域被至少40個(gè)reads覆蓋。9.6％人基因組區(qū)域覆蓋深度降低（<40×），反映文庫制備方案的PCR步驟中的擴(kuò)增偏差（圖1f）。

圖1

使用multi-platform Genomes in a Bottle (GIAB)作為黃金標(biāo)準(zhǔn)真實(shí)數(shù)據(jù)集評(píng)估ONT檢測(cè)SNV的準(zhǔn)確性。NA12878樣本22號(hào)染色體數(shù)據(jù)運(yùn)行FreeBayes方法檢測(cè)SNV，選擇獲得最佳F1分?jǐn)?shù)的參數(shù)，與GIAB參考變異檢測(cè)集相比，實(shí)現(xiàn)了99.9％的總體一致性準(zhǔn)確度，并且觀察到12.8％的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）和14.4％假陰性率（FNR），結(jié)合創(chuàng)造了86.4％的F1分?jǐn)?shù)（表1）。在全基因組水平使用上述參數(shù)，獲得了10.9％的FDR，12.5％的FNR和88％的F1分?jǐn)?shù)。

表1

為了更好地理解變異檢測(cè)錯(cuò)誤的潛在來源，作者注釋了變異檢測(cè)位點(diǎn)，其中包含一系列關(guān)于參考序列和跨越位點(diǎn)的reads注釋。這些包括接近均聚物重復(fù)區(qū)域、較低的覆蓋深度、鏈偏好和存在大量短缺失的reads覆蓋區(qū)域（圖2左）。表明，假陽性（FP）和假陰性的主要驅(qū)動(dòng)因素是均聚物和低覆蓋率。此外，使用高質(zhì)量評(píng)分閾值（QUAL）來維持可接受的FDR會(huì)產(chǎn)生許多假陰性。

圖2

初始變異集中的大部分假陽性基因型是雜合基因型。使用ONT數(shù)據(jù)的好處是跨越多個(gè)雜合位點(diǎn)的長(zhǎng)reads提供了糾正此問題的機(jī)會(huì)。當(dāng)reads被分成代表親本單倍型的2組時(shí)，預(yù)期真陽性變異等位基因只固定在一個(gè)定相組（親本單倍體）存在，而假陽性變異預(yù)期在組之間均勻分布。據(jù)此，作者開發(fā)了單樣本、基于reads、無參考panel的定相算法。

使用過濾器改進(jìn)變異檢測(cè)，通過phasing和注釋過濾器（Post?phasing classification）顯著改善變異檢測(cè)，最佳結(jié)果F1評(píng)分為92.2％，F(xiàn)DR為7.1％，F(xiàn)NR為8.5％（表1，圖2中）。進(jìn)一步考慮覆蓋深度>=60X的假定變異位點(diǎn)（基因組的85％）時(shí)，觀察到F1得分改善至93.6％，F(xiàn)DR為6.1％，F(xiàn)NR為6.6％（圖2右），這意味著減少或消除覆蓋深度偏差源（如PCR）的操作改進(jìn)在提高準(zhǔn)確性方面可以發(fā)揮一定作用。(百邁客目前ONT全基因組重測(cè)序和ONT全基因組甲基化測(cè)序建庫過程正是PCR-free建庫--direct-DNA建庫，一是可減少覆蓋深度偏好，有利于提高變異檢測(cè)準(zhǔn)確度；二是可以保留堿基修飾信息，同時(shí)檢測(cè)甲基化修飾等信息

在推定的致病LOF變異（功能缺失突變：本文針對(duì)終止密碼子獲得和剪接位點(diǎn)突變）中，與全基因組真陽性突變（173/788782,0.02％）相比，F(xiàn)Ps（假陽性突變，69/45219,0.15％）富集，但FPs在高度不耐受LOF突變的基因（pLI>0.90,17 FP對(duì)20 TP）與LOF突變耐受基因（pLI <= 0.10,46 FP對(duì)122 TP）中成比例地富集。

在每條read隨機(jī)堿基替換錯(cuò)誤和無基因組擴(kuò)增偏差的理想化模型下模擬NA12878數(shù)據(jù)集，與實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)比較，表明均聚物缺失錯(cuò)誤累積導(dǎo)致缺失變異檢測(cè)錯(cuò)誤，納米孔測(cè)序中增加的測(cè)序覆蓋深度以減小均聚物相關(guān)FDR，目前受到基因組范圍的in-read缺失率的限制。

基因型是通過母本或父本單倍型遺傳的，但大多數(shù)基因分型方法，會(huì)產(chǎn)生非定相基因型檢測(cè)，即無法區(qū)分單倍型。基因型定相很有意義，除了上述促進(jìn)變異檢測(cè)準(zhǔn)確性的改進(jìn)之外，還能夠進(jìn)行許多遺傳分析，比如臨床用途中解決多個(gè)雜合LoF變異的共分離和鑒定新生突變的起源親本。作者開發(fā)的新型定相算法相比于其他算法，具有更低的錯(cuò)誤率，其定相精確度類似于使用非常大的參考panel從SNP基因分型陣列數(shù)據(jù)定相常見變異所獲得的定相精確度。

大的結(jié)構(gòu)變異相對(duì)于snp和indel少見，但其對(duì)罕見疾病的影響可能甚至比目前估計(jì)的更大，因?yàn)楝F(xiàn)有分析檢測(cè)這些突變存在技術(shù)困難。采用Sniffles檢測(cè)22號(hào)染色體SV變異，共計(jì)檢測(cè)到82個(gè)，其中22個(gè)是在GIAB真實(shí)數(shù)據(jù)集中存在的，之后通過ONT、Illumina和PacBio reads覆蓋數(shù)據(jù)來判斷剩余的60個(gè)SV：其中21個(gè)SV被Pacbio檢測(cè)到或reads強(qiáng)烈支持，31個(gè)SV僅ONT reads明顯證實(shí)，但PacBio reads很少或不支持。ONT特異性檢測(cè)SV可能代表其他技術(shù)遺漏的真實(shí)缺失、由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的假象或在NA12878細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)期間發(fā)生的亞克隆缺失。作者發(fā)現(xiàn)目前ONT平臺(tái)允許檢測(cè)大的缺失，靈敏度在60％-91％（21/35和32/35）。

僅ONT檢測(cè)到的缺失突變示例

鑒于長(zhǎng)reads可成功地檢測(cè)雜合變異，作者試圖使用全基因組納米孔測(cè)序來解決具有不確定的免疫調(diào)節(jié)病癥的個(gè)體基因組臨床問題。簡(jiǎn)而言之，女性患者最初在嬰兒期出現(xiàn)復(fù)發(fā)性感染、低丙種球蛋白血癥、血小板減少癥和輕度貧血，并且在兒童時(shí)期出現(xiàn)慢性炎癥，在成年早期出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

患者及其父母組成的核心家系3個(gè)樣本Illumina平臺(tái)全基因組重測(cè)序（PE 126bp）結(jié)果：發(fā)現(xiàn)了84個(gè)高置信度的新生SNV，一個(gè)接近預(yù)期范圍上限的數(shù)字，這與受孕時(shí)的父母年齡（母親是38歲，父親39歲）一致。其中3個(gè)變異預(yù)測(cè)為導(dǎo)致蛋白序列改變，2個(gè)位于SAMD9L基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)中。該基因中罕見的雜合變異最近涉及常染色體顯性遺傳性共濟(jì)失調(diào)性全血細(xì)胞減少綜合征（OMIM：＃159550），并且有證據(jù)表明造血組織的出生后逆轉(zhuǎn)可能與較輕微的疾病表現(xiàn)相關(guān)。雖然這2個(gè)非同義突變（c.1076 G>A和c.3353 A>G; p.R359Q和p.Y1118C，NM_152703.3）位于同一個(gè)外顯子中，但它們相距2277 bp，所以不能直接使用Illumina reads進(jìn)行定相；其附近缺乏遺傳的雜合變異也阻止將突變定相于親本單倍型。解釋這個(gè)問題對(duì)于解釋每個(gè)等位基因的致病潛力非常重要，解決此類問題的能力與類似情況下的生殖決策直接相關(guān)。

全血樣本Nanopore全基因組重測(cè)序結(jié)果：在34個(gè)R9.4 MinION flowcell中共計(jì)產(chǎn)生122 Gb數(shù)據(jù)量（16,692,656 reads，約40X），比對(duì)率為99.1％。通過上述在NA12878樣本確定的變異檢測(cè)和定相方法進(jìn)行分析。

ONT數(shù)據(jù)基因組覆蓋深度統(tǒng)計(jì)

不出所料，ONT數(shù)據(jù)也鑒定到了具有預(yù)期雜合基因型的c.1076 G> A和c.3353 A> G變異。使用ONT reads對(duì)其他附近變異進(jìn)行定相，以確認(rèn)新生變異的遺傳和來源（圖3）。這2個(gè)新生突變被定相于一個(gè)199kb的block內(nèi)，33條reads（6.1-18.9kb）跨越2個(gè)新生突變位點(diǎn)，11條reads包含新生突變等位基因，8條reads包含2個(gè)參考等位基因，表明突變的等位基因是順式的（來自于同一條染色體）。（NA12878數(shù)據(jù)中沒有reads跨越包含2個(gè)位點(diǎn)的突變等位基因。）使用一系列等位基因特異性PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)來自O(shè)NT reads的新生等位基因的單倍型構(gòu)象。相位區(qū)中的側(cè)翼位點(diǎn)表明，父系遺傳的單倍型出現(xiàn)了新生變異（圖3）。

圖3及等位基因特異性PCR結(jié)果

注：前3行為未定相母親（MI），父親（FI），先證者（PI）基因型，第4行為先證者單倍型Phased proband genotypes (PN)。藍(lán)色=alt ，橙色=ref。PN下面2行為單倍型1（母系遺傳）或單倍型2（父系遺傳）對(duì)應(yīng)的reads，其中對(duì)于每條read，堿基是矩形，reads跨度以水平線顯示。間隙代表gap（缺失）。底部顯示物理位置，感興趣的位點(diǎn)為紅色?；贕RCh37 NM_152703.3, 92761932 T>C對(duì)應(yīng)于c.3353 A>G，92764209 C>T對(duì)應(yīng)于c.1076 G>A。

該研究首次詳細(xì)評(píng)估了ONT測(cè)序?qū)θ祟悩颖镜淖儺悪z測(cè)和基因分型、染色體定相（單倍型分析）的準(zhǔn)確性。雖然很有希望，在總共107個(gè)MinION flowcell中對(duì)這2個(gè)人類基因組進(jìn)行測(cè)序是一項(xiàng)重大任務(wù)，在技術(shù)和計(jì)算等方面具有挑戰(zhàn)。最近商業(yè)化推出的PromethION是一種更高通量的納米孔測(cè)序儀，自帶數(shù)據(jù)處理功能，有望解決人類基因組規(guī)模數(shù)據(jù)中的許多挑戰(zhàn)。（百邁客與Oxford Nanopore公司合作-斥巨資引進(jìn)Nanopore全測(cè)序平臺(tái)）最后，雖然變異檢測(cè)的總體準(zhǔn)確性仍存在局限性，但該工作突出了錯(cuò)誤上下文，這些錯(cuò)誤上下文將受益于基本檢測(cè)、reads比對(duì)和一致性變異檢測(cè)方法的改進(jìn)，并說明了將ONT應(yīng)用于臨床目的的途徑。

小編碎語：隨著nanopore測(cè)序技術(shù)的發(fā)展更新，比如最新ONT內(nèi)測(cè)的R10芯片75X達(dá)到一致性質(zhì)量值Q50，比如新的'flip-flop'堿基識(shí)別軟件可將R9一致性準(zhǔn)確性提升至Q42等?？傊?，ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序錯(cuò)誤率down down down，測(cè)序通量up up up，測(cè)序價(jià)格low low low，三代取代二代指日可待。誰說魚（長(zhǎng)讀長(zhǎng)）和熊掌（準(zhǔn)確度）不可兼得呢。

Bowden R, Davies R W, Heger A, et al. Sequencing of human genomes with nanopore technology[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1869.

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