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間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一群多能細(xì)胞，具有通過(guò)調(diào)節(jié)再生和炎癥優(yōu)異的促進(jìn)組織修復(fù)能力。MSCs在疾病治療中的療效依賴(lài)于產(chǎn)生的同源性細(xì)胞群體的相對(duì)數(shù)量。但是，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的MSCs的細(xì)胞異質(zhì)性和分化的軌跡（方向）尚未闡明。文章分析了來(lái)源于兩個(gè)臍帶（UC-MSCs）的361個(gè)MSCs單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。對(duì)這些收獲于不同時(shí)期的UC-MSCs采用炎癥因子刺激或者不刺激。通過(guò)加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析意外發(fā)現(xiàn)UC-MSCs僅僅擁有有限的異質(zhì)性且與供體和細(xì)胞代際無(wú)關(guān)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)用炎性細(xì)胞因子（IFNγ和TNFα）預(yù)處理后，這種經(jīng)典的策略可以提高M(jìn)SCs的治療效果，并且處理后MSCs的基因表達(dá)出現(xiàn)一致性的變化?；诩?xì)胞周期依賴(lài)的主成分分析顯示，鑒定出具有有限異質(zhì)性的這些UC-MSC與它們進(jìn)入G2 / M期密切相關(guān)。并觀察到特異性基因CD168以細(xì)胞周期依賴(lài)性方式表達(dá)。CD168陽(yáng)性的細(xì)胞體外分選和培養(yǎng)時(shí)，CD168的表達(dá)依然顯示出對(duì)周期的依賴(lài)。研究結(jié)果表明，體外擴(kuò)增的UC-MSCs是一群具有以細(xì)胞周期為主的有限異質(zhì)性的細(xì)胞。因此，本研究為基于MSCs的疾病治療提供了標(biāo)準(zhǔn)化的信息。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是由俄羅斯科學(xué)家Alexander Friedenstein在20世紀(jì)60年代后期從骨髓（BM）中發(fā)現(xiàn)的多能細(xì)胞，他觀察到骨髓是生物體出生后間充質(zhì)組織的干細(xì)胞庫(kù)。如今，MSCs的鑒定基于它們的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，一系列的表面標(biāo)志物表達(dá)狀態(tài)及其三系分化潛能。由于MSCs的自我更新特性和多重分化潛能，體外擴(kuò)增MSCs在再生醫(yī)療中具有廣闊的前景。(人們)已經(jīng)可以從各種組織和器官中分離出來(lái)MSCs，盡管骨髓來(lái)源的MSCs最廣泛地用于潛在的治療探索，臍帶來(lái)源的UC-MSCs似乎更適合于臨床應(yīng)用。與BM-MSCs相比，UC-MSCs更易于大量獲取，省去了骨髓穿刺的麻煩。重要的是,UC-MSCs源于生命的早期階段，并且在體內(nèi)移植中，具有較低的免疫原性。盡管UC-MSCs主要用于異體移植治療，但是它們的治療效果已經(jīng)在一些臨床前和臨床研究中得到了證實(shí)。

在過(guò)去十幾年中，由于MSCs的棉衣調(diào)節(jié)能力，顯示出MSCs在組織再生的臨床應(yīng)用與管控炎癥性疾病中取得了令人矚目的成就。MSCs在治療炎癥性疾病具有驚人的效果，首先發(fā)現(xiàn)于一名患有類(lèi)固醇和環(huán)孢菌素抗性GvHD5的9歲患者；然而，這一治療效果并不是總能復(fù)現(xiàn)。考慮到炎癥在調(diào)動(dòng)MSCs免疫抑制能力關(guān)鍵作用，一系列的臨床治療采用聯(lián)合IFNγ and TNFα炎性細(xì)胞因子來(lái)體外預(yù)處理MSCs，從而改善了MSCs在自身免疫性疾病的治療效果。在限制MSCs在臨床應(yīng)用中的療效的突出因素中，MSCs群體的標(biāo)準(zhǔn)化被歸于首位。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs在體外擴(kuò)增中存在形態(tài)和增殖速率方面存在差異。此外，來(lái)自不同克隆的MSCs展現(xiàn)出不同的克隆集落形成和分化能力，這些證據(jù)表明，來(lái)自不同供體，組織，克隆甚至來(lái)自同一克隆集落的不同細(xì)胞的MSCs可能存在異質(zhì)性。迄今為止，關(guān)于人類(lèi)MSCs的大多數(shù)研究都是基于混合群體，迫切需要對(duì)MSC的單細(xì)胞分析進(jìn)行詳細(xì)研究，以闡明各種特性的變化。

本研究中，我們采用了最新的微流體單細(xì)胞捕獲系統(tǒng)和高通量測(cè)序技術(shù)研究人UC-MSCs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的異質(zhì)性。我們分析了361個(gè)UC-MSCs。其中的159個(gè)暴露與炎性細(xì)胞因子中。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的UC-MSCs存在細(xì)胞亞群。通過(guò)對(duì)這些基因的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期分布是UC-MSC中異質(zhì)性來(lái)源的重要原因。結(jié)合其他一些研究的信息，我們的結(jié)果表明UC-MSCs是一群相對(duì)同源的細(xì)胞群，并且分離和擴(kuò)增方案中的標(biāo)準(zhǔn)化具有較高的可能獲得更好的臨床療效。

采用Fluidigm C1 Autoprep System在微流控芯片上捕獲細(xì)胞；NEBNext Ultra 試劑盒構(gòu)建RNA文庫(kù)，Illumina Hiseq 2500進(jìn)行測(cè)序。在被檢測(cè)的基因中，經(jīng)過(guò)低表達(dá)基因過(guò)濾(在至少1/10細(xì)胞中檢測(cè)到，每個(gè)細(xì)胞平均1個(gè)讀數(shù)）5498個(gè)基因中的4753個(gè)被保留，這些基因所在的數(shù)據(jù)集被用于下游分析。

• 數(shù)據(jù)過(guò)濾：移除含有接頭，多聚N與低質(zhì)量的reads；

• 比對(duì):參考基因組hg19，Top Hat (v2.1.0)比對(duì)

• 基因過(guò)濾：采用HTSeq v0.6.1計(jì)算map到每一個(gè)基因上的read數(shù)量；歸一化測(cè)序深度；差異基因使用DESeq2， Genes that had read counts with a row sum of zero were removed.。

• 聚類(lèi)分析與可視化：使用SCDE軟件的R包識(shí)別MSCs的亞群。簡(jiǎn)而言之，用spike-in RNAs的峰值計(jì)算基因表達(dá)水平和變異的回歸線，用顯著偏離擬合的基因進(jìn)行分層聚類(lèi)，將單個(gè)細(xì)胞分為亞群。使用SCDE軟件R包進(jìn)行兩個(gè)條件/組的差異表達(dá)分析（每個(gè)條件下兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。SCDE軟件包通過(guò)使用負(fù)二項(xiàng)分布和低水平泊松分布的混合來(lái)模擬每個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)用于擬合單細(xì)胞RNA-seq測(cè)量的個(gè)體誤差模型的程序。

• 數(shù)據(jù)獲得：表達(dá)矩陣獲得https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117837

細(xì)胞分群

通過(guò)對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，202個(gè)未處理細(xì)胞使用外加標(biāo)1,4,7的RNA或ERCC作為內(nèi)參，識(shí)別 出高度可變的基因，并通過(guò)主成分分析，在所有的四個(gè)數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了（huc2_p0， huc2_p2，huc2_p5，huc1_p5）幾個(gè)亞群

MSCs免疫抑制性

MSCs最獨(dú)特的特征之一，是它們的免疫抑制功能和治療各種炎性疾病的有效性。如今關(guān)注的問(wèn)題是在MSCs細(xì)胞中炎癥誘導(dǎo)的基因表達(dá)是否存在異質(zhì)性。在用IFNγ和TNFα刺激后，分析了159個(gè)UC-MSCs細(xì)胞huc1_sti_p5，huc2_sti_p2和huc2_sti_p5）(Figs 1 and 2)。通過(guò)無(wú)偏的層次聚類(lèi)，在所有的數(shù)據(jù)集中識(shí)別出了一個(gè)明顯的亞群(Fig. 2） 。

細(xì)胞周期階段決定了MSC的異質(zhì)性

我們接下來(lái)檢查了細(xì)胞周期軌跡對(duì)UC-MSCs中異質(zhì)性的影響。我們采用基于評(píng)分細(xì)胞周期相關(guān)基因的分類(lèi)方法，并描述每個(gè)細(xì)胞在G1/S和G2/M期中表達(dá)細(xì)胞的特征基因。通過(guò)顯示紅色的CD168/HMMR陽(yáng)性細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞位于右上方，表明它們處于G2/M期 (Fig. 4)。為了進(jìn)一步證實(shí)與細(xì)胞周期相關(guān)的其他特征基因（BRCA1，CDCA5, MELK，HMMR，RACGAP，PRC和HMGB1）的相關(guān)性，我們檢查了它們的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)與CD168/HMMR 陽(yáng)性的MSCs類(lèi)似，富集在圖的右上角(Fig. 4)。

我們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論供體和代級(jí)如何，UC-MSCs中基因表達(dá)的異質(zhì)性是有限的。此外，經(jīng)炎性細(xì)胞因子（IFNγ和TNFα）刺激的UC-MSCs在基因表達(dá)中顯示相似的多樣性模式，表明有無(wú)炎性細(xì)胞因子刺激UC-MSCs均具有有限異質(zhì)性。我們發(fā)現(xiàn)了包括BRCA1，CDCA5,MELK，HMMR，RACGAP，PRC和HMGB1在內(nèi)的七個(gè)特征基因。更深一步地分析顯示，異質(zhì)性在很大程度上與UC-MSCs的細(xì)胞周期階段有關(guān)。自從骨髓中首次鑒定獲得MSCs后，如今幾乎可以從所有的組織中獲得MSCs。骨髓來(lái)源的BM-MSCs在臨床應(yīng)用中最為常見(jiàn)，與來(lái)自它組織中的MSCs相比，UC-MSCs具有大規(guī)模擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)化的巨大潛力。UC-MSCs單細(xì)胞基因譜分析顯示個(gè)體細(xì)胞存在異質(zhì)性，不同細(xì)胞分別表現(xiàn)出明顯的增殖和分化潛能?；赨C-MSCs大小的分類(lèi)顯示，形態(tài)較小的細(xì)胞生長(zhǎng)更快，更為年輕。此外，利用多色慢病毒條形碼標(biāo)記作為UC-MSC克隆發(fā)育的分析工具，發(fā)現(xiàn)在體外擴(kuò)增期間可以減少M(fèi)SCs的異質(zhì)性。因此，體外擴(kuò)增的MSCs間的異質(zhì)性的鑒別和應(yīng)用反應(yīng)了它們?cè)诩膊≈委熤袘?yīng)用的治療機(jī)會(huì)?？紤]到不同供體來(lái)源和擴(kuò)增過(guò)程中可供選擇的MSCs的克隆。

為了揭示UC-MSCs有限異質(zhì)性的本質(zhì)，我們分析了特征基因，發(fā)現(xiàn)綠松石模塊與細(xì)胞周期調(diào)控有非常密切的關(guān)系。令人意想不到的是觀察到了細(xì)胞周期基因聚類(lèi)的模塊和免疫相關(guān)分子聚類(lèi)的模塊之間負(fù)相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)UC-MSCs亞群大多處于G2/M期，UC-MSCs的異質(zhì)性（有無(wú)炎性細(xì)胞因子刺激）均受細(xì)胞周期進(jìn)程的控制?？傊覀兺ㄟ^(guò)對(duì)UC-MSC單細(xì)胞RNA測(cè)序的分析揭示了UC-MSC的異質(zhì)性主要是由細(xì)胞周期階段的不同分布引起的。除了在研究MSC生物學(xué)方面有價(jià)值之外，該信息還對(duì)MSC標(biāo)準(zhǔn)化和采用MSC治療各種疾病的發(fā)展具有重要意義。