近幾年，RNAseq測序價格極大降低，許多老師大量的做RNAseq。RNAseq是對樣品中的totalRNA提取并進行高通量測序，通過分析獲得各類分子的表達量。通過對照組與處理組等比較得到差異表達的基因，并對差異基因進行如GO/KEGG富集，了解處理因素影響的生物學過程、通路等。
RNAseq是RNA分子測序的總稱，常見的有mRNA測序，miRNA測序，lncRNA測序，circRNA測序，也可以全部測序，稱為全轉(zhuǎn)錄組測序。
這幾類測序都需要先獲得樣品的totalRNA, 根據(jù)所需要分子的不同?？梢詫Ω黝惙肿臃謩e提取，比如用polyA法提取mRNA，進行測序，獲得編碼蛋白的基因表達譜；通過電泳獲得10-50bp左右的small RNA，并進行測序，獲得miRNA表達譜。通過去除rRNA，富集長鏈的RNA的方法獲得lncRNA, mRNA表達譜；通過去除線性RNA的方法獲得circRNA的表達譜。
通過RNAseq可以篩選出差異表達的分子，進而選取分子進行驗證，構建調(diào)控機制。但可能整個實驗的周期很長，比如1-2年時間，甚至更長。通過接觸很多的客戶，發(fā)現(xiàn)許多老師，在我們這里做了RNAseq實驗，希望先對RNAseq的數(shù)據(jù)進行分析，整理，希望純數(shù)據(jù)分析或者稍加驗證就可以發(fā)表文章，雖然這類文章看過很多，但沒有總結(jié)明確的規(guī)律，秉承解決客戶一起問題的原則，我們接下來，對幾十篇這類文章進行分析。以了解RNAseq純分析類文章該如何構思，如何描述數(shù)據(jù)，放哪些圖等。
我們繼續(xù)看一下“中藥研究RNA-seq分析文獻2”這篇文章。
牛蒡子苷元是一種抗癌藥物，探討EriB對血管生成的影響，以斑馬魚為動物模型，觀察斑馬魚胚胎中腸下靜脈的形成。分別用3種劑量的藥物（5，10和15μM)處理斑馬魚胚胎72小時時，SIV的形成受到抑制。那么問題來了，抑制的機理時什么，胚胎內(nèi)哪些基因發(fā)生了改變，哪些生物學功能，通路發(fā)生了改變？然后作者，將對照，10um藥物組，15um藥物組樣品拿去做RNAseq。并進行生物信息學分析，獲得差異基因及其涉及的生物學過程、通路等。
RNAseq結(jié)果展示1（附件）：對照組、藥物濃度1組、藥物濃度2組差異基因展示及GO/KEGG結(jié)果。
說明：A是所有的差異表達基因，1500個，可以看出，作者沒有做生物學重復，由于基因過多，所以未顯示基因名字。這是一個差異表達基因的常用展示方法，將所有差異基因做個熱圖。B，對差異基因做KEGG，找通路。C，GO分析中的生物學過程。D：細胞組分，E：分子功能，F(xiàn)：主要的蛋白結(jié)構域。這里展示的是-log10(p-value)。有些老師覺得是不是必須用padj，我覺得沒必要。
RNAseq結(jié)果展示2（正文）：使用p<0.05篩選差異基因，發(fā)現(xiàn)有72個差異表達，1 up-regulated and 51 down-regulated(p < 0.05)。
結(jié)果說明：A圖是選出來的72個基因的熱圖。一般來說，我門在正文里放熱圖 時，多選擇一部分與實驗相關的基因，比如本文的抗血管生成的基因。我經(jīng)常跟老師講，RNAseq的熱圖一般是不能直接用的，公司給出的是所有差異基因的熱圖，或者top100這樣的熱圖。而文中的熱圖要根據(jù)實驗需要挑選基因放熱圖。所以寫文章時需要找公司重新繪制熱圖。所以公司的服務質(zhì)量非常重要。如果不知選哪個公司做RNAseq，找我們就好了。B圖是挑選的部分大于2倍的基因做的qPCR。說明與RNAseq的結(jié)果一致。
RNAseq結(jié)果展示3（附件）：差異基因列表
作者將差異基因列表作為附件，如下:
RNAseq結(jié)果展示4（附件）：差異基因富集的GO/Pathway
接下來，作者對做了細胞的周期、增殖等檢測，說明牛蒡子苷元對細胞的影響，同時找了靶標通路。
這篇文章，我們可以看出，RNAseq是對細胞、對所有基因的整體描述，通過全基因表達譜，我們可以看出細胞基因發(fā)生了哪些變化，通路發(fā)生了哪些變化等。
該文RNAseq展示的結(jié)果，是所有差異基因熱圖，差異基因列表，差異基因GO/KEGG富集圖，富集通路表，重要基因熱圖。
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齊天飏丨寫
李紀偉丨審
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