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隨著液態(tài)活檢的快速發(fā)展，采用體液對患者的分子特征進行分析成為可能，特別是基于循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的高通量測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，因其無創(chuàng)或微創(chuàng)、檢測時間短、能夠反映瘤內(nèi)和轉(zhuǎn)移灶異質(zhì)性、可動態(tài)監(jiān)測治療療效等優(yōu)勢而在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。與腫瘤組織樣本相比，采用ctDNA進行基因檢測在樣本收集和處理、檢測技術(shù)要求、結(jié)果解讀和臨床應(yīng)用等方面存在諸多不同，且目前國內(nèi)尚缺少ctDNA基因檢測標(biāo)準(zhǔn)，因此限制了其在臨床上的規(guī)范應(yīng)用。

為此，中國抗癌協(xié)會腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會組織國內(nèi)腫瘤臨床、病理、檢驗、生物信息分析和高通量檢測領(lǐng)域?qū)＜?，參考國?nèi)外 ctDNA 臨床應(yīng)用共識、指南和最新文獻，結(jié)合國內(nèi)外現(xiàn)有的高通量測序技術(shù)要求和臨床實踐，從ctDNA的生物學(xué)特征、臨床應(yīng)用價值和范圍、高通量檢測的標(biāo)準(zhǔn)要求及其未來發(fā)展趨勢等方面提出本共識，以促進ctDNA NGS的健康規(guī)范發(fā)展。

ctDNA 通常由腫瘤細胞主動分泌或在腫瘤細胞凋亡或壞死過程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)中的 DNA 片段，長度 132~145 bp，半衰期較短（一般<2 h）。ctDNA 會攜帶來源于腫瘤細胞相關(guān)的遺傳學(xué)特征，如基因突變、甲基化、擴增或重排等，可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評估及預(yù)后風(fēng)險分層的重要指標(biāo)。

ctDNA 水平一般呈動態(tài)變化，且受多種因素影響：⑴腫瘤病理組織類型、部位、分期、腫瘤負(fù)荷等因素可影響ctDNA的釋放。在腫瘤負(fù)荷較輕、特定部位（如顱內(nèi)腫瘤）和特定組織學(xué)（如膠質(zhì)瘤），以及增殖、凋亡和/或血管化水平較低的腫瘤患者中，ctDNA水平通常較低^［1］。⑵大量其他來源的 DNA 干擾。如其他正常細胞或白細胞來源的DNA，與ctDNA一起被稱為游離 DNA（cell free DNA，cfDNA）。多種生理和病理因素，如懷孕、劇烈運動、外傷、炎癥、心肌梗死、自身免 疫 性 疾 病 和 急 性 中 風(fēng) 等 也 會 影 響 cfDNA 的 釋放^［2?3］。⑶克隆性造血細胞產(chǎn)生的cfDNA攜帶的基因突變信息可能會干擾ctDNA檢測結(jié)果^［4］。此外，其突變基因還受不同內(nèi)外因素影響（包括年齡、吸煙、種族和腫瘤治療等），如ASXL1突變在吸煙者中富集，DNA損傷應(yīng)答（DNA?damaged response，DDR）基因（TP53、PPM1D、CHEK2）突變在接受放射、鉑類藥物和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑治療的腫瘤患者中更為常見^［5］。⑷ctDNA 半衰期較短（一般<2 h），不同采樣時間可能影響 ctDNA 含量^［6］。⑸藥物治療影響 ctDNA 含量。有研究顯示，非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）患者接受酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療后，ctDNA 含量在 24 h 達到頂峰，隨后快速降低，提示藥物也會影響ctDNA含量^［7］。

與組織學(xué)檢測相比，ctDNA檢測具有無創(chuàng)或微創(chuàng),可反復(fù)取材，收集、處理和分析報告周轉(zhuǎn)時間（turn?around time，TAT）短等優(yōu)勢^［8］。同時能克服腫瘤空間異質(zhì)性，可相對全面地實時反映患者的腫瘤分子特征^［9］。與單獨組織活檢相比，血漿ctDNA還可增加驅(qū)動基因突變檢出率^［10］。然而，與組織標(biāo)本相比，外周血 ctDNA含量較低，容易造成臨床檢測假陰性結(jié)果。由于胚系變異或克隆性造血突變的存在，若未用白細胞作為對照，也可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果^［11?12］。此外，不同腫瘤患者或同一患者不同時段釋放入血的 ctDNA 量也存在差異，這也給 ctDNA 的臨床檢測和結(jié)果解讀帶來困難。一項對中國 66家 ctDNA NGS檢測實驗室質(zhì)控的回顧分析顯示，ctDNA檢測報告書寫質(zhì)量相對滿意的實驗室僅占 42.4%，其中 74.2% 的報告僅列了相應(yīng)癌種與目前治療藥物最相關(guān)的基因變異結(jié)果，對檢測方法細節(jié)和相應(yīng)檢測局限缺乏詳細的描述^［13］。

2.1 ctDNA NGS檢測在腫瘤伴隨診斷中的價值

伴隨診斷（companion diagnostics，CDx）被認(rèn)為是腫瘤個性化醫(yī)療中不可或缺的工具，其要求測試結(jié)果所提供的信息足以保證相應(yīng)治療藥物的安全性和有效性，預(yù)期用途為指導(dǎo)用藥，識別能夠從特定治療中受益的患者。ctDNA 檢測作為 CDx 在最早的臨床實踐應(yīng)用是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變檢測，主要用于識別可能從EGFR TKI 獲益的晚期 NSCLC 患者。在 ENSURE 研究中，ctDNA 檢測 EGFR 19del 和 L858R 突變的特異性為98.2%，敏感性為 76.7%；而根據(jù) ctDNA 檢測結(jié)果接受厄洛替尼治療的患者較化療患者的PFS明顯改善^［14］?；谠撗芯拷Y(jié)果，F(xiàn)DA 于 2016 年批準(zhǔn)首款液體活檢CDx產(chǎn)品Cobas EGFR Mutation Test v2，隨后國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）于 2019 年批準(zhǔn)該款 CDx 產(chǎn)品在國內(nèi)上市。在FLAURA研究中，ctDNA T790M 陽性患者對奧希替尼的客觀緩解率（objective response rate，ORR）與腫瘤組織活檢陽性患者一致^［15］。據(jù)此，2020年FDA批準(zhǔn) Guardant360 CDx 用于血漿 ctDNA 檢測以識別可 獲 益 于 奧 希 替 尼 治 療 的 EGFR L858R / 19del /T790M 突 變 ，埃 萬 妥 單 抗（JNJ?6372）對應(yīng)的 EGFR 20ins突變以及索托拉西布對應(yīng)的 KRAS G12C突變的NSCLC 患者^［16］。隨后又批準(zhǔn)適用范圍更廣的一款CDx產(chǎn)品 FoundationOne Liquid CDx，主要用于識別包括 NSCLC EGFR 敏感突變（L858R/19del）、ALK 重排、MET 14號外顯子跳躍，前列腺癌BRCA1/2及ATM突變，上皮性卵巢癌/輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌 BRCA1/2突變以及乳腺癌PIK3CA突變，以指導(dǎo)其藥物^［17］。

當(dāng)前EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET、RET、NTRK及KRAS（G12C 突變）等驅(qū)動基因陽性的晚期 NSCLC 一線靶向治療藥物相繼獲批，基于ctDNA檢測結(jié)果的臨床治療選擇日益獲得注冊臨床試驗與真實世界研究的證據(jù)支持。有研究顯示，在轉(zhuǎn)移性NSCLC中，對于指南推薦的生物標(biāo)志物，ctDNA檢測較僅采用組織活檢的患者可額外增加48%的檢出率，且可顯著降低檢測報告TAT（9 d vs 15 d，P<0.0001）^［8］。NSCLC NCCN 指 南2022 V1 版推薦不宜開展有創(chuàng)活檢的晚期患者，或所獲得的組織標(biāo)本質(zhì)量不佳，或標(biāo)本量不足以開展必需的多基因變異檢測時，可以開展包含EGFR、ALK、ROS1、BRAF 、MET 、RET 和KRAS（G12C 突 變）等 在 內(nèi) 的ctDNA NGS檢測，但也同時提醒ctDNA NGS檢測存在30%左右的假陰性，以及相應(yīng)分析會受到克隆性造血影響^［18］。2021年，國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）共識指出，ctDNA可作為初診NSCLC晚期患者進行基因分型的有效工具，其結(jié)果通?？膳c組織分析結(jié)果互補，也可以作為診斷生物標(biāo)志物評估和監(jiān)測靶向治療療效的首選策略（其中血漿優(yōu)先）^［19］。

基于 SOLAR?1 研究^［20］結(jié)果，F(xiàn)DA 于 2019 年批準(zhǔn)第二款液體活檢 CDx 產(chǎn)品 Therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit。該產(chǎn)品主要通過血漿 ctDNA 檢測識別受益于PIK3CA抑制劑阿培利司（與氟維司群聯(lián)合）治療的PIK3CA 突變晚期 HR /HER2?乳腺癌患者^［21］。一項關(guān)于乳腺癌的薈萃分析顯示，ctDNA 檢測 PIK3CA 突變的敏感性和特異性分別為 86% 和98%^［22］。乳腺癌NCCN 指南 2022 V1 版推薦，復(fù)發(fā)不可切除或轉(zhuǎn)移性HR /HER2?乳腺癌應(yīng)進行基于穿刺組織或 ctDNA 的PIK3CA 突變分析，若首選 ctDNA 檢測但結(jié)果呈陰性時，應(yīng)再次進行組織檢測確認(rèn)^［23］。

在胃食管腺癌中，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶往往存在異質(zhì)性，ctDNA 檢測可全面反映全身腫瘤情況，從而更有效地指導(dǎo)精準(zhǔn)治療^［24］。研究顯示聯(lián)合組織和血漿ctDNA HER2擴增檢測可提高對食管癌及食管胃交界部癌患者抗 HER2 治療的預(yù)測價值^［25］。胃癌和食管癌及食管胃交界部癌 NCCN 指南 2022 V1 建議不適合組織活檢的胃癌和食管癌患者可考慮進行血漿ctDNA NGS檢測^{［26? 27］}，但同時強調(diào)ctDNA檢測為陰性時并不排除經(jīng)組織分析基因變異的存在。此外，由于尚缺乏有效的治療手段，NCCN 指南 2022 V1 建議轉(zhuǎn)移性胰腺癌在無法經(jīng)活檢獲得足夠組織時可考慮進行ctDNA NGS檢測，且至少應(yīng)包括ALK、NRG1、NTRK、ROS1 融合基因變異與 BRAF、BRCA1/2、HER2、KRAS、PALB2 基因突變分析^［28］。皮膚惡性黑色瘤 NCCN 指 南 2022 V1 也提及 ctDNA NGS 檢測可作為其分子分型的替代性方式^［29］。近期已有研究^［30?32］初步顯示，基于 ctDNA NGS檢測篩選參與臨床試驗患者具有足夠的準(zhǔn)確性，且在不影響療效的情況下可提高試驗入組率，縮短篩查時間。這些研究結(jié)果提示 ctDNA NGS 檢測在臨床試驗中具有一定優(yōu)勢和應(yīng)用前景。然而，除了已獲批的伴隨診斷產(chǎn)品，大多數(shù) ctDNA 在其他靶向治療指導(dǎo)的有效性和實用性證據(jù)依然不足，尚需大量實驗結(jié)果和臨床試驗支撐，后續(xù)研究應(yīng)盡可能納入預(yù)期適用人群，通過嚴(yán)格設(shè)計的臨床研究充分驗證其臨床意義^［33］。針對不同癌種，血漿ctDNA 腫瘤基因突變檢測與腫瘤組織基因突變檢測的一致性仍存在較大差異，對于檢測結(jié)果差異較大的癌種，應(yīng)綜合考慮其臨床應(yīng)用風(fēng)險，慎重考慮 ctDNA NGS 檢測作為組織基因檢測替代方式的可行性。

作為采用腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)等傳統(tǒng)方法評估分子靶向和免疫檢查點抑制劑治療療效時無法動態(tài)反映腫瘤特征性的分子演化，ctDNA NGS檢測可對腫瘤驅(qū)動基因相關(guān)ctDNA的豐度變化進行監(jiān)測，判斷腫瘤治療應(yīng)答，其中在NSCLC的EGFR靶向治療中，EGFR敏感突變早期清除可用于預(yù)測 EGFR TKI 療效^［34］。一項動態(tài)監(jiān)測 ctDNA 預(yù)測 NSCLC 臨床治療療效的真實世界研究發(fā)現(xiàn)，基線ctDNA含量越高或變異數(shù)量越多，預(yù)示著 OS 越短（治療后 ctDNA 清除的患者 PFS 和 OS更長），而且 ctDNA 也是與治療類型和評估時相點設(shè)置無關(guān)的獨立預(yù)后因素^［35］。接受免疫檢查點抑 制 劑 治 療 的 晚 期 NSCLC 患 者 ，ctDNA 響 應(yīng)（降 低>50%）與影像學(xué)評估的療效吻合，且與更好的PFS和OS相關(guān)，其中治療后5~9周早期影像評估為病灶穩(wěn)定的患者，ctDNA評估為響應(yīng)的患者中位OS顯著延長（31.2 個月 vs 18.4 個月，HR=0.36）^［36］。受體型蛋白酪氨酸磷酸酶 D（protein tyrosine phosphatase，receptor type D，PTPRD）在多種腫瘤中表達失活^［37］，在非鱗NSCLC 中 PTPRD 磷酸酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生缺失性突變時，二線治療能更多從阿特珠單抗中獲益（中位 OS：24.04個月 vs 9.69個月，HR=0.16，P=0.0273），并且PTPRD是獨立的預(yù)后因素^［38］，且不依賴于 TMB 和 PD?L1 表達或（和）TP53、EGFR、KRAS 基因突變狀態(tài)。在轉(zhuǎn)移性激素抵抗前列腺癌中，ctDNA水平降低與PSA降低超過30%相關(guān)^［39］。TOPARP ?A 研究也發(fā)現(xiàn) ，接受PARP 抑制劑治療的晚期前列腺癌患者 ctDNA 降低與 OS 相關(guān)^［40］。但在近期一項黑色素瘤合并腦轉(zhuǎn)移免疫檢查點抑制劑治療研究中發(fā)現(xiàn)血漿 ctDNA 分析并不能很好地監(jiān)測顱內(nèi)病灶療效，這顯示了血腦屏障對 ctDNA 檢測的不利影響^［41］。

微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）概念最早來自血液腫瘤。實體腫瘤的MRD概念更多被稱為分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD），是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)（包括 PET/CT）或其他實驗室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表腫瘤持續(xù)存在和臨床進展可能。TracerX研究證實了ctDNA作為 MRD檢測的可行性并評估了MRD 檢測對 NSCLC 術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值^［42］。一項回顧性研究納入了 22 例接受新輔助治療（大多為新輔助免疫治療）的ⅠB~ⅢA 期 NSCLC 患者，其 ctDNA動態(tài)分析結(jié)果與術(shù)后病理學(xué)評價高度一致，敏感性為100.00%、準(zhǔn)確性為 91.67%，其中術(shù)后 3~8 d ctDNA 檢測陽性的患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險（HR=5.37），且基于ctDNA NGS檢測預(yù)測分子復(fù)發(fā)事件較影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評估的中位時間提前了6.83 個月^［43］。2021 年《非小細胞肺癌分子殘留病灶專家共識》將肺癌分子異常定義為在外周血可穩(wěn)定檢測出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅(qū)動基因或其他Ⅰ/Ⅱ類基因變異^［44］。一項通過檢測 ctDNA 監(jiān)測 MRD 的臨床研究納入 261 例可手術(shù)根治切除的NSCLC患者，結(jié)果顯示，術(shù)前ctDNA檢測發(fā)現(xiàn) 36.4% 的患者為陽性，表明可能存在未發(fā)生 ctDNA脫 落 的 腫 瘤（non ? shedding tumor），但 不 影 響 術(shù)后MRD監(jiān)測^［45］。該研究還發(fā)現(xiàn)術(shù)后單個節(jié)點 MRD 檢測 陰 性 患 者的預(yù)后顯著優(yōu)于陽性患者（HR=0.08，95%CI：0.02~0.33），說明動態(tài)監(jiān)測可進一步提升預(yù)測準(zhǔn)確性，這一結(jié)果首次定義了潛在治愈人群，且發(fā)現(xiàn)術(shù)后 MRD 陰性人群不能從輔助治療獲益；僅腦部復(fù)發(fā)的患者 MRD 檢出比例顯著降低（20%，1/5）。在結(jié)腸癌患者中，術(shù)后ctDNA連續(xù)監(jiān)測較影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評估最多可提前 16.5個月預(yù)測分子復(fù)發(fā)事件^［46］。多項研究表明，結(jié)直腸癌術(shù)后及輔助治療后ctDNA陽性與疾病復(fù)發(fā)之間呈強相關(guān)性，術(shù)后的ctDNA分析結(jié)果可作為預(yù)后預(yù)測依據(jù)^［47?48］。近期，首項基于ctDNA的結(jié)腸癌術(shù)后輔助治療隨機對照試驗 DYNAMIC 結(jié)果顯示，ctDNA 指導(dǎo)下的輔助化療策略可以在不影響患者總體無復(fù)發(fā)生存期的前提下，降低接近50%（從28%降低至 15%）的術(shù)后輔助化療率，避免了部分患者的無效化療^［49］。該研究為Ⅱ期結(jié)腸癌患者的術(shù)后輔助治療決策提供了直接依據(jù)。IMvigor010 是一項高危肌層浸潤性尿路上皮癌輔助免疫治療的Ⅲ期臨床研究，研究結(jié)果顯示 ctDNA 陽性患者接受阿替利珠單抗的中位無病生存期和OS顯著改善，復(fù)發(fā)風(fēng)險降低42%，死亡風(fēng)險降低 41%^［50］。目前，眾多公司推出實體瘤MRD 檢測產(chǎn)品，但并無獲批（FDA/NMPA）產(chǎn)品上市，亟待通過大樣本、多中心、前瞻性臨床試驗驗證這些產(chǎn)品的臨床效用^［51］。

獲得性耐藥是影響腫瘤精準(zhǔn)治療療效的重要因素，也是抗腫瘤藥物臨床應(yīng)用全程管理面臨的最大挑戰(zhàn)。ctDNA NGS 檢測由于自身優(yōu)勢現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤獲得性耐藥分子機制分析及后續(xù)的用藥指導(dǎo)。如接受奧希替尼治療的晚期NSCLC患者發(fā)生耐藥時，EGFR基因常檢出新的突變，其中EGFR G796/C797突變占24.7%，EGFR L792突變占10.8%，EGFR L718/G719突變占 9.7%^［52］?；?ctDNA NGS 檢測發(fā)現(xiàn) ALK 抑制劑耐藥機制具有高度異質(zhì)性，如克唑替尼耐藥時常發(fā)生 ALK L1196M、I1171T、D1203N、G1269A/ F1174L等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān)的 NRAS G12V、EGFR R108K、PIK3CA E545K 等突變；塞瑞替尼耐藥時常發(fā)生ALK G1128A、G1202R、G1269A、I1171T/E1210K 等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān) KIT D820E、MET E1012*、EGFR P265_C291del 等突變；阿 來替尼耐藥時常發(fā)生ALK G1202R、W1295C、G1202R/L1196M 等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān) EGFR P753S 突變；洛拉替尼耐藥時常發(fā)生 ALK G1202R/G1269A 繼發(fā)突變，可能存在旁路激活 BRAF V600E、 MET D1246N等突變^［53］。在接受抗 EGFR單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，RAS信號通路中蛋白編碼基因的突變和/或 EGFR 胞外結(jié)構(gòu)域（extra-cellular domain，ECD）改變可能是導(dǎo)致耐藥的主要分子機制^［54?57］。在胃癌治療中，ctDNA監(jiān)測發(fā)現(xiàn)HER2拷貝數(shù)改變提示曲妥珠單抗耐藥性，因此認(rèn)為ctDNA中的HER2拷貝數(shù)可作為監(jiān)測曲妥珠單抗治療進展期胃癌的療效指標(biāo)^［58?59］。

腫瘤免疫檢查點抑制劑治療獲得性耐藥機制復(fù)雜，治療選擇壓力下的腫瘤亞克隆演進僅為部分原因。在當(dāng)前最活躍的腫瘤轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域中，ctDNA靶向測序、全外顯子和（或）全基因組檢測，乃至單細胞組學(xué)、宏基因組、空間基因組學(xué)等諸多新技術(shù)已開始被應(yīng)用。在阿維魯單抗（avelumab）聯(lián)合 EGFR 單抗、改良 FOLFOX6 方案治療微衛(wèi)星穩(wěn)定、RAS/BRAF野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的Ⅱ期臨床試驗中，基于 ctDNA NGS 檢測發(fā)現(xiàn)選擇性壓力下會繼發(fā) PD?L1 突變亞克隆演化，少數(shù)患者可出現(xiàn)導(dǎo)致 RNA 衰減的 PD ? L1 K162fs 突變以及增強蛋白降解的 PD ?L1 L88S 亞克隆^［60］。然而，盡管目前的研究顯示基于 ctDNA NGS檢測在探索腫瘤耐藥分子機制和用藥指導(dǎo)中有一定優(yōu)勢，尤其可為疑難或復(fù)雜病例的臨床診斷或治療方案制定提供重要參考，但是作為一種新興的技術(shù)手段，尚缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)支撐其在臨床實踐中常規(guī)應(yīng)用。相信隨著臨床有效性和效用性研究的不斷深入，ctDNA 檢測在腫瘤耐藥方面將發(fā)揮更大的價值，從而使更多患者獲益。

3.2.1 檢測流程與質(zhì)量控制 ctDNA NGS檢測的建立與優(yōu)化涉及分析前、分析中以及分析后的三個階段多個步驟，實驗室質(zhì)量管理需貫穿ctDNA NGS檢測的整個流程。分析前階段包括樣本采集、運輸、保存等處理，每個步驟應(yīng)制定與實驗室實際操作相符合的SOP，并按照SOP執(zhí)行。分析中階段包括“濕實驗”和“干實驗”兩個步驟，“濕實驗”包括核酸提取、引物或探針設(shè)計合成、文庫制備、上機測序等步驟，其中文庫制備可選擇雜交捕獲或擴增子建庫，該階段的質(zhì)控應(yīng)對核酸提取中的核酸濃度、純度和片段分布做出相應(yīng)要求并遵照執(zhí)行；“干實驗”涵蓋生物信息學(xué)分析流程各步驟，該階段質(zhì)控應(yīng)對最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、鳥嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine，GC）含量、堿基識別質(zhì)量值、比對質(zhì)量值和在靶率等作出相應(yīng)要求并遵照執(zhí)行。分析后階段包括檢測報告解讀、分子腫瘤專家委員會（molecular tumor board，MTB）討論和遺傳咨詢等，該階段應(yīng)制定結(jié)果報告及解讀SOP，并遵循準(zhǔn)確、及時和充分的原則。此外，實驗室應(yīng)根據(jù)實際情況，建立室內(nèi)質(zhì)量控制，室間質(zhì)量評價以及室室比對等SOP，并遵照執(zhí)行。

3.2.2 試劑性能驗證或性能確認(rèn) 實驗室使用已獲批的高通量測序試劑開展臨床檢測服務(wù)前，必須對試劑進行性能驗證。如果實驗室改變已批準(zhǔn)試劑指定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流程，則按照LDT試劑要求進行管理，臨床檢測前需對檢測系統(tǒng)（包含人、機、料、法、環(huán)等）的分析性能進行確認(rèn)。實驗室應(yīng)建立試劑性能確認(rèn)檢測操作全過程SOP，明確試劑的分析性能指標(biāo)和檢測局限性。分析性能評價指標(biāo)至少應(yīng)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報告范圍。

3.3 樣本收集、處理原則

3.3.1 樣本采集和前處理 建議采用含細胞穩(wěn)定劑的抗凝管，如Streck采血管等游離核酸專用采血管，實驗室也可根據(jù)實際情況選擇合適的采血管。根據(jù)檢測要求采集適量的外周血，一般為10 mL，采血后輕柔顛倒8~10次，使保存液和血液充分混合，避免凝血或溶血發(fā)生^［61］。血液離體后應(yīng)盡快送至檢測實驗室。實驗室應(yīng)根據(jù)實際情況制定保存運輸時限及溫度要求。建議采用兩步離心法分離血漿，第一步：2~8 ℃，1 600~1 900 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；第二步：2~8 ℃，16 000~20 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管。分離血漿可直接抽提ctDNA，或保存于-80 ℃至使用時，保存過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融^［62］。

3.3.2 樣本制備與質(zhì)控 臨床上目前常用的cfDNA提取方法有離心柱法和磁珠法，應(yīng)根據(jù)檢測要求選擇合適的方法。提取的核酸應(yīng)在2~8 ℃下儲存且不超過24 h；若超過24 h，建議在-30 ℃至-15 ℃下儲存，并避免反復(fù)凍融。進行文庫制備前，建議采用合適的技術(shù)方法對獲得的cfDNA總量和片段分布進行分析，判斷是否滿足實驗室制定的質(zhì)控要求。若不滿足后續(xù)檢測需求，應(yīng)采取相應(yīng)措施處理，必要時重新采集樣本。

3.4 ctDNA NGS檢測技術(shù)要點

3.4.1 文庫構(gòu)建策略 采用NGS方法進行ctDNA檢測的靶向測序策略主要分為兩種：基于雜交捕獲的靶向NGS（hybrid capture NGS）和基于擴增子的靶向NGS（amplification-based NGS）^［63］。基于雜交捕獲的靶向NGS方法是通過捕獲探針與基因組中特定區(qū)域雜交，從而獲得目的區(qū)域的序列并進行分析的方法^［64］。該方法操作步驟多，過程相對復(fù)雜，需要1~2 d完成建庫上機，可以檢測點突變，小片段的插入缺失和拷貝數(shù)變異，以及DNA層面的基因重排，且可以發(fā)現(xiàn)一些未知融合，檢測靈敏度可達95%以上。目標(biāo)序列捕獲法建庫使用的探針設(shè)計有DNA探針和RNA探針，主要對目標(biāo)區(qū)域進行靶向富集，確保樣本目標(biāo)序列完全富集，提高富集效率和覆蓋的均一性，有效降低測序成本?；跀U增子的靶向NGS方法依賴多重PCR擴增步驟富集目標(biāo)序列。實驗過程中，基于擴增的文庫制備的實際操作時間通常比雜交捕獲方法短。對于基因數(shù)目較少，用藥相關(guān)熱點突變明確的panel可以采用靶向擴增子測序，擴增均一性在引物設(shè)計時需要優(yōu)化調(diào)試。兩種測序策略各有優(yōu)劣，實驗室可依據(jù)檢測的靶向測序panel大小、基因種類、突變類型及時效要求等選擇不同測序策略，并依據(jù)專利技術(shù)進行適當(dāng)優(yōu)化，從而提升基因文庫的構(gòu)建質(zhì)量和效率。不論采用何種方法，每個檢測項目都應(yīng)設(shè)定明確的合格文庫標(biāo)準(zhǔn)^［65］，上機測序前應(yīng)對文庫濃度和文庫片段分布進行分析，合格的文庫標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括片段是否相對集中，有無游離接頭，有無接頭二聚體，片段大小是否在推薦文庫片段范圍內(nèi)等內(nèi)容。

3.4.2 分子標(biāo)簽策略 對于cfDNA樣本的突變檢測下限期望達到0.1%甚至更低時，僅靠增加測序深度已不足以提升靈敏度，建庫過程PCR結(jié)果引入的錯誤和測序造成的系統(tǒng)誤差都會增加假陽性結(jié)果。使用分子標(biāo)簽技術(shù)和優(yōu)化對應(yīng)的生物信息分析設(shè)置，可以過濾由于測序平臺隨機誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，從而實現(xiàn)更高的靈敏度。其原理是在文庫制備過程中，通過添加一段3~8 bp隨機序列作為分子標(biāo)簽（unique molecular identifier，UMI），該法可以靈敏地識別PCR重復(fù)片段并校正PCR擴增錯誤，從而進行正確的DNA片段溯源，提供更可靠的突變分析。

3.4.3 參數(shù)確定策略 對于大多數(shù)實體惡性腫瘤，血漿中的ctDNA水平較低，突變等位基因分?jǐn)?shù)在晚期轉(zhuǎn)移性疾病中通常低于10%，在局部晚期非轉(zhuǎn)移性疾病中低于1%^［66］。ctDNA水平在癌癥早期和治愈性治療后更低，其突變等位基因頻率通常小于0.1%^［67-68］。因此，需要高度靈敏的方法檢測血漿ctDNA。中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟（CAGC）建議血漿cfDNA標(biāo)本的NGS有效測序深度應(yīng)達到1 000×以上，并應(yīng)在80%以上的目標(biāo)區(qū)域達到這個深度，而非所有區(qū)域的平均，否則在區(qū)域間覆蓋波動較大的情況下，會有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況^［69］。肺癌微小病灶殘留定義、檢測與應(yīng)用中國胸部腫瘤學(xué)專家共識中指出：采用NGS靶向測序多基因檢測panel進行MRD檢測時，基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是可穩(wěn)定檢出豐度≥0.02％的ctDNA。NCCN指南推薦且應(yīng)用相對成熟的Signatera擴增子NGS技術(shù)的平均測序深度高達100 000×以上^［70］。這也提示早期癌癥檢測和微小病灶殘留檢測需要更高的測序深度。目前檢測策略眾多，不同策略對測序深度和廣度的標(biāo)準(zhǔn)也有待進一步的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

3.4.4 測序平臺選擇 目前使用較多的NGS測序平臺是因美納（Illumina）、華大智造（MGI）和賽默飛（Thermo fisher）平臺。盡管技術(shù)性能相似，但平臺之間DNA投入要求、試劑成本、運行時間和讀取長度等均存在差異。Illumina平臺高通用性和可擴展性高，可對不同大小靶向測序panel進行靈活分析。同時也需要更高的DNA和RNA投入，測序時間長，測序成本高，需要更全面的生物信息學(xué)支持。MGI平臺在有高通用性和可擴展性的同時，還具有測序重復(fù)率低、有效數(shù)據(jù)利用率高、測序速度快、測序成本相對較低等優(yōu)勢，尤其適合用于需要高數(shù)據(jù)量的ctDNA檢測。Thermo fisher平臺通量小、測序時間短、測序成本低，同時配備內(nèi)置生物信息學(xué)分析流程，便于數(shù)據(jù)自動化分析^［71］?？傊?，三大測序平臺各有優(yōu)劣，不同實驗室可以依據(jù)樣本量、測序數(shù)據(jù)量以及時效要求等選擇相應(yīng)的測序平臺。

3.5.1 基于分子標(biāo)簽技術(shù)的數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析 ctDNA檢測常出現(xiàn)PCR重復(fù)序列比例高（50%~90%）、PCR擴增和測序錯誤等引入的背景噪音高等問題。同時，血液中白細胞的克隆性造血突變也影響ctDNA變異的鑒定?；诜肿訕?biāo)簽技術(shù)的分析流程可幫助有效去除背景噪音，配對白細胞樣本或背景庫的建立可有效去除來自白細胞中克隆性造血突變引入的假陽性，提升ctDNA檢測的準(zhǔn)確性。UMI通過給每一條原始DNA片段加上一段特有的標(biāo)簽序列，經(jīng)文庫構(gòu)建和PCR擴增后一同測序，根據(jù)不同的標(biāo)簽序列可以區(qū)分不同來源的DNA模板，分辨源于PCR擴增及測序過程中隨機錯誤產(chǎn)生的假陽性突變，識別cfDNA中真正來源于腫瘤的突變，從而提高檢測靈敏度和特異性，可達0.1%的檢出限^［71］。一般推薦1條UMI對應(yīng)并至少3條reads。

3.5.2 測序噪音控制 建立背景庫過濾噪聲的大致思路是通過使用相同測序流程的樣本估計基因組坐標(biāo)對應(yīng)區(qū)域或堿基的測序錯誤率，然后使用假設(shè)檢驗等統(tǒng)計方法比較目標(biāo)樣本對應(yīng)坐標(biāo)的突變頻率是否顯著高于估計得出的測序錯誤率。通過對患者腫瘤樣本建立背景庫過濾噪聲的常用方法有SiNVICT和OutLyzer。SiNVICT使用腫瘤樣本計算出一段基因組區(qū)域的噪音水平，通過計算信噪比的方法過濾潛在的假陽性結(jié)果^［72］。OutLyzer通過計算目標(biāo)突變附近200 bp內(nèi)的每個坐標(biāo)的測序錯誤率，并通過多次Thompson’s Tau Test過濾離群噪聲^［73］。在可用樣本較為充足的情況下，使用多個患者的正常樣本建立背景庫能較準(zhǔn)確地估計噪聲水平。其中代表方法有Mutect1/Mutect2（GATK）^［74］，該法使用不少于40個沒有腫瘤細胞污染的正常樣本構(gòu)建背景庫。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的基于不同算法的構(gòu)建背景庫算法，如基于二項分布的TNER、基于高斯分布模擬的IDES ^［75］、基于泊松分布的AmpliSolve^［76］等，均可有效提升突變檢出準(zhǔn)確率和召回率，去除背景噪音。

3.5.3 克隆性造血變異過濾 RAZAVI等^［77］發(fā)現(xiàn)ctDNA存在大量未知來源的基因變異（variants of unknown source，VUSo），大部分VUSo突變豐度<1%，與樣本測序深度、DNA起始量、位點的測序深度、樣本染色體拷貝數(shù)無相關(guān)性，且有很好的重復(fù)性結(jié)果。在白細胞樣本中也檢測到大量的VUSo，且與年齡呈正相關(guān)，證實了ctDNA中的大部分VUSo來自白細胞，并非來源于測序背景噪音，這部分VUSo突變被定義為克隆性造血突變。因此，在不同ctDNA高通量測序臨床應(yīng)用場景，需要考慮ctDNA中包含有源于白細胞的克隆性造血突變。ctDNA檢測時通過配對的白細胞樣本，或者匯集整合檢測到的克隆性造血突變，構(gòu)建克隆性造血突變背景庫，可有效幫助去除克隆性造血造成的假陽性。

3.5.4 數(shù)據(jù)的儲存與管理 隨著測序深度的增加，ctDNA下機數(shù)據(jù)有效安全的儲存需要配備相應(yīng)的基礎(chǔ)設(shè)施。高通量測序會生成大量文件，下機的fastq或bam原始文件、vcf結(jié)果文件等需長期保存，同時應(yīng)保存好測序過程中完整的日志文件，以便區(qū)分高通量測序分析軟件版本信息、追溯異常結(jié)果。診斷實驗室應(yīng)保存相關(guān)數(shù)據(jù)至少3年，并在相關(guān)技術(shù)人員的支持下制定數(shù)據(jù)備份計劃和恢復(fù)計劃。

3.6.1 專業(yè)團隊建設(shè) 實驗室負(fù)責(zé)人應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)背景、分子生物學(xué)相關(guān)工作經(jīng)歷、副高級以上專業(yè)技術(shù)職稱。主要報告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等多種專業(yè)背景，了解腫瘤的臨床治療指南以及臨床試驗最新進展，最好具有2 年及以上腫瘤組織多基因NGS檢測分析工作經(jīng)歷。報告如涉及基因胚系變異分類與臨床意義闡釋，建議結(jié)合臨床遺傳咨詢同步開展。旨在進行ctDNA NGS檢測全面分析與復(fù)雜臨床場景應(yīng)用的機構(gòu)，鼓勵建立由多學(xué)科專家組成的MTB。

3.6.2 報告內(nèi)容 ctDNA NGS檢測的臨床報告應(yīng)包含以下內(nèi)容：⑴受檢者的基本信息。應(yīng)明確包含受檢者姓名、性別、出生日期或年齡、接受檢測的日期、檢測的目的（需要明確疾病發(fā)病狀態(tài)或攜帶者狀態(tài)）和受檢者的臨床指征（應(yīng)至少包含疾病的診斷或初步診斷）等。⑵樣本信息。每份樣本應(yīng)有唯一標(biāo)識，注明樣本類型、采集時間、采集部位、送檢時間、檢測報告時間和樣本主要質(zhì)控情況（如DNA質(zhì)量評估以及測序質(zhì)量評估等）。⑶實驗室信息。包括實驗室名稱、實驗操作人員、報告審核人員、聯(lián)系方式。⑷檢測項目。包括基因panel的檢測位點及檢測范圍、檢測儀器、檢測試劑，是否為NMPA批準(zhǔn)使用的檢測試劑以及NMPA獲批的基因位點信息，或LDT試劑、檢測方法、檢測下限等。⑸檢測結(jié)果及變異解讀。對基因變異的檢測結(jié)果進行解讀，如檢出的基因型、變異結(jié)果、染色體變化情況、檢測結(jié)果的致病性分級、藥物信息及臨床意義、變異解讀引用的參考文獻等；對于多次檢測的患者，報告需要體現(xiàn)既往檢測結(jié)果，并綜合解讀本次檢測結(jié)果。⑹標(biāo)注檢測方法的實驗室內(nèi)部驗證結(jié)果，檢測局限性及不確定性，以及進一步檢測的建議^［78］。

3.6.3 變異結(jié)果的命名規(guī)則 對基因變異的描述應(yīng)遵循一定的原則和規(guī)范，推薦參考人類基因組變異協(xié)會命名指南（www.hgvs.org，登錄日期2022年6月22日），轉(zhuǎn)錄本的選擇建議采用基因座參考基因組序列數(shù)據(jù)庫（Locus reference genomic；www.lrg-sequence.org，登錄日期2022年6月22日） 界定的轉(zhuǎn)錄本或多個國際數(shù)據(jù)庫公認(rèn)的主要轉(zhuǎn)錄本。對遺傳性腫瘤相關(guān)基因變異的說明，建議以美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院（American college of medical genetics and genomics） 指南為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測結(jié)果中列出具體的變異位點信息，包括基因名稱、所參考的人類基因組版本號、轉(zhuǎn)錄本參考序列版本號、核苷酸變異、氨基酸變異、外顯子/內(nèi)含子序號、等位基因雜合性、染色體編號及坐標(biāo)等^［79］。

3.6.4 指導(dǎo)用藥的循證分級規(guī)范 對于腫瘤體細胞突變的臨床意義解讀，建議依據(jù)伴隨診斷、臨床指南、數(shù)據(jù)庫或文獻證據(jù)進行分級，可以將腫瘤體細胞基因突變分為臨床意義明確（Ⅰ級）、有潛在臨床意義（Ⅱ級）、臨床意義不明確（Ⅲ級） 和良性或可能良性突變（Ⅳ級）。實驗室應(yīng)建立突變臨床意義分類及分級和報告的SOP，且SOP應(yīng)至少包括以下兩個方面：⑴對體細胞基因突變進行分級的流程; ⑵明確報告中應(yīng)包含哪一級或哪幾級突變位點。分級的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來源的指南、文獻、數(shù)據(jù)庫、證據(jù)等級、分級結(jié)果等。臨床證據(jù)決定突變位點分級，可參考AMP、ASCO、CAP聯(lián)合發(fā)布的腫瘤樣本測序突變解讀共識^［80］。

對胚系突變的臨床意義解讀，可參考中外診療指南及重要參考文獻，Online mendelian inheritance in man （https：//omim.org，登錄日期2022年6月22日）和美國ACMG指南等資源。目前，對于胚系突變分級主要參考ACMG指南，其將變異位點致病性等級分為致病、疑似致病、臨床意義未明、疑似良性和良性等5個等級。報告中應(yīng)列出與遺傳性腫瘤（如遺傳性乳腺癌/卵巢癌綜合征、Lynch綜合征等） 相關(guān)的致病以及疑似致病變異，并對變異的致病性進行分析解讀^［79］。對于意義不明位點的處理，實驗室需制定相關(guān)政策，確定是否報告臨床意義不明的位點，并附上說明和參考數(shù)據(jù)庫，并且要在報告中注明本實驗室出具臨床報告的規(guī)則。

3.6.5 其他檢測方法的結(jié)果驗證 對血液樣本進行高通量測序檢測時如出現(xiàn)較低豐度的突變結(jié)果（通常血液樣本低于檢測下限） 時，建議綜合評估高通量測序?qū)嶒炂脚_性能、測序深度以及腫瘤細胞比例等因素。特別對于靶向治療相關(guān)的基因，建議使用其他檢測方法進一步驗證確認(rèn)，如數(shù)字PCR等方法。

3.6.6 檢測局限性聲明 外周血中ctDNA含量不足，由于受檢者攜帶的突變可能沒有包含在檢測基因譜中等原因，檢測可能存在假陰性結(jié)果。如果血漿檢測結(jié)果為陰性，必要時仍需采用其他類型樣本進行驗證。另外，由于大多數(shù)基于ctDNA NGS未配對檢測白細胞，如果存在胚系變異或由克隆性造血引起的體細胞突變，也可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果^［81］，因此在結(jié)果報告中應(yīng)對ctDNA的檢測基因范圍、檢測方法和檢測下限等重要性能指標(biāo)進行說明。當(dāng)通過ctDNA NGS檢測進行靶向用藥指導(dǎo)或遺傳性腫瘤風(fēng)險評估時，其評估標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)綜合考慮驅(qū)動分子事件、臨床治療因素以及分析篩選策略。ctDNA NGS臨床檢測報告的解讀對腫瘤患者預(yù)后、復(fù)發(fā)監(jiān)測、用藥指導(dǎo)具有重要的參考價值。因此，報告應(yīng)該明確、簡潔、準(zhǔn)確，并具有充分的解讀、可信性和權(quán)威性。

目前已有部分基于基因變異信息的復(fù)合預(yù)測生物標(biāo)志物用于預(yù)測免疫檢查點抑制劑和分子靶向治療療效，從而對患者進行分層，如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）。臨床研究表明基于ctDNA NGS檢測的bMSI（blood MSI）和bTMB（blood TMB）具有免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測價值^［35］。FDA于2020年8月26日批準(zhǔn)基于ctDNA NGS數(shù)據(jù)擬合bMSI和bTMB的試劑盒用于泛實體瘤多個靶向藥物及免疫檢查點抑制劑的伴隨診斷。但bMSI和bTMB在臨床應(yīng)用中受多種因素影響，如樣本采集時間、檢測panel基因覆蓋范圍、panel大小、測序深度、生信算法及閾值設(shè)定等，因此還需要更多的前瞻性臨床研究證據(jù)支持ctDNA NGS數(shù)據(jù)擬合的bMSI和bTMB的臨床應(yīng)用前景。

同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）檢測在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑和鉑類藥物敏感性預(yù)測及腫瘤易感性評估中具有重要的臨床應(yīng)用價值^［82］。HRD狀態(tài)可通過同源重組相關(guān)基因突變（homologous recombination repair，HRR）檢測和基因瘢痕（genomic scar，GS）檢測兩種方式判斷。目前僅有兩種組織檢測試劑Myriad MyChoice- CDx以及Foundation FocusTM CDx BRCA LOH獲得FDA批準(zhǔn)用于伴隨診斷及補充診斷。兩者均采用HRR聯(lián)合GS檢測策略評估HRD狀態(tài)。由于基于ctDNA NGS對GS進行評估技術(shù)上具有巨大挑戰(zhàn)，所以目前基于ctDNA NGS檢測進行HRD評估主要集中在HRR信號通路基因SNP檢測，但國內(nèi)外對HRR基因的定義尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；另外，隨著檢測技術(shù)的進步，基于ctDNA NGS評估GS逐漸成為可能，但目前基于ctDNA NGS檢測評估HRD尚有巨大的探索空間。

ctDNA中包含核酸序列、位點突變、拷貝數(shù)、甲基化、MSI、序列長度、序列豐度、出現(xiàn)的時空模式、在基因組上的位置特征、起始位點和終止位點特征等豐富的生物信息，如腫瘤cfDNA片段的長度分布、核小體位置與正常細胞顯著不同，這些信息可應(yīng)用于腫瘤篩查和診斷中^［83］。為了更好地整合多源異質(zhì)信息，更全面描繪腫瘤生物特征，大幅提高ctDNA數(shù)據(jù)的效力，機器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等人工智能算法也被大量應(yīng)用到腫瘤的篩查和診斷中。CancerSEEK的癌癥早篩項目通過監(jiān)測ctDNA中16個基因的突變及血清8個蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物水平，并構(gòu)建 Logistic回歸模型，結(jié)果該模型在8種腫瘤共包含1 005例患者中的敏感性為69%~98%，特異性為 99% ^［84］。最新的應(yīng)用機器學(xué)習(xí)分類器輔助的深度甲基化測序能檢測到52%~81% 臨床分期為ⅠA~Ⅲ期的患者，且檢測限低至萬分之一，顯示了更高的敏感性和特異性（特異性為96%，95%CI：93%~98%）^［85］。

總之，基于ctDNA NGS檢測的bTMB具有免疫檢查點抑制劑療效預(yù)測價值，但仍有諸多因素影響bTMB檢測在臨床中的應(yīng)用，未來還需開展更多的前瞻性臨床研究。機器學(xué)習(xí)等人工智能算法不僅能降低假陽性、提高靈敏度，還能有效整合多維度的異質(zhì)信息進行全面分析，大幅提高ctDNA數(shù)據(jù)效力，是ctDNA數(shù)據(jù)分析的主要方向。

利益沖突聲明：本共識由專家組內(nèi)部成員針對性討論得出，專家組編寫過程中未接受生物醫(yī)藥公司任何形式的贊助，所有專家組成員均聲明不存在利益沖突。