原文出處：Zhong W, Wu K, Long Z,et al. Gut dysbiosis promotes prostate cancer progression and docetaxel resistance via activating NF-κB-IL6-STAT3 axis. Microbiome. 2022 Jun 16;10(1):94.
研究背景：
據(jù)GLOBOCAN 2020 年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，前列腺癌在全球男性的發(fā)病率中排名第二，死亡率位居第五。因此，探究前列腺癌的發(fā)病機制和新的治療方法十分必要。過去十年中，越來越多的研究聚焦在腸道微生物群對腫瘤進展以及治療的作用。然而，現(xiàn)有研究多集中在腸道微生物群與腸道腫瘤之間的聯(lián)系，關(guān)于腸道微生物如何影響腸外惡性腫瘤（如前列腺癌）仍知之甚少。本研究中，作者猜想抗生素處理可導(dǎo)致腸道微生物群失調(diào)進而激活炎癥信號通路并促進前列腺癌的進展。研究發(fā)現(xiàn)抗生素處理可促進前列腺癌的生長，其作用由腸道微生物群介導(dǎo)。研究結(jié)果：
結(jié)果一：廣譜抗生素處理可導(dǎo)致小鼠腸道菌群失調(diào)，進而促進前列腺癌生長。
作者首先連續(xù)給予C57BL/6J小鼠廣譜抗生素（Abx）處理，包括氨芐青霉素、粘菌素、新霉素和萬古霉素，以建立腸道微生物群失調(diào)小鼠模型。隨后將RM-1細胞移植到小鼠皮下建立前列腺癌皮下移植瘤模型。（圖1A）4-5 周后，與對照組相比，抗生素干預(yù)增加了皮下腫瘤體積和重量。（圖1B）在原位移植的腫瘤中也觀察到了相同的結(jié)果。（圖1C）此外，為了進一步確定腸道微生物群是否介導(dǎo)這一現(xiàn)象，作者進行了糞菌移植實驗（FMT）。結(jié)果顯示，與 FMT對照組相比，FMT-Abx 組的皮下腫瘤體積和重量增加。（圖1E）腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析顯示，Abx 和 FMT-Abx 組中 Ki-67 陽性腫瘤細胞的數(shù)量增多。（圖1F）以上結(jié)果表明抗生素干預(yù)促進了小鼠前列腺癌的生長，這與腸道微生物群失調(diào)有關(guān)。圖1
結(jié)果二：抗生素處理后，腸道中變形菌門的相對豐度顯著升高。
為了探究腸道微生物群的組成，作者收集了來自小鼠的糞便樣本，包括Abx、FMT-Abx、NC和FMT-NC組，并進行 16S rRNA 測序。主坐標分析結(jié)果表明Abx和FMT-Abx組之間以及NC和FMT-NC 組之間的菌群組成相似。（圖2A）接下來，在不同的分類水平上評估了四組的腸道微生物群譜。作者發(fā)現(xiàn)，在門水平上，擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度在NC和FMT-NC組中占優(yōu)勢，而變形菌門的相對豐度在Abx和FMT-Abx組中顯著富集。(圖2B)在科水平上，ABX和FMT-ABX組中，鼠桿科和毛螺科顯著減少。(圖2C)為了確定每組中的生物標志物物種，作者計算了線性判別分析效應(yīng)大小后發(fā)現(xiàn)變形菌是ABX和FMT-ABX組中得分最高的物種。（圖2D）總之，抗生素干預(yù)顯著改變了腸道細菌群落的組成。變形桿菌的相對豐度增加，是腸道微生物群失調(diào)的標志。圖2結(jié)果三：瘤內(nèi)LPS激活NF-κB-IL6-STAT3軸
LPS作為一種重要的炎癥誘導(dǎo)因子，在人類多種腫瘤中均可檢測到，隨后作者猜想腸道微生物群失調(diào)（以變形菌門富集為特征）導(dǎo)致腸道屏障受損，LPS釋放到循環(huán)中，進而到達腫瘤。為了證明這一點，作者進行了ELISA實驗，結(jié)果表明，雖然NC組糞便中的LPS水平明顯高于Abx組，但血清中卻有相反的趨勢。此外，在Abx組的結(jié)腸中觀察到一定程度的損傷。(圖3A)以上結(jié)果表明，ABX組小鼠存在腸漏。此外，LPS在ABX組的腫瘤中顯著增加。（圖3B）已知 LPS 通過激活 TLR4-NF-κB 通路刺激多種細胞因子分泌來引發(fā)炎癥反應(yīng)。作者通過大腸桿菌的重組LPS培養(yǎng)RM-1細胞，并通過RT-qPCR檢測細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。作者發(fā)現(xiàn)IL-6的相對倍數(shù)變化明顯高于其他細胞因子。隨后，ELISA實驗證實細胞上清液中IL-6的蛋白水平也顯著升高。（圖3C）隨后作者通過RPPA和基因富集分析發(fā)現(xiàn)IL6和p-STAT3之間呈正相關(guān)，顯示JAK-STAT通路上調(diào)。（補充圖2A）同時，作者發(fā)現(xiàn)p-STAT3和p-p65（NF-κB的主要轉(zhuǎn)錄亞單位）的表達水平之間存在正相關(guān)。（補充圖2B）此外作者發(fā)現(xiàn)p-p65和p-STAT3在給予LPS的RM-1細胞核中增加（圖3D），并呈劑量依賴性。給予p65磷酸化抑制劑處理后，IL6的轉(zhuǎn)錄水平以及p-p65和p-STAT3的蛋白質(zhì)水平降低。（圖3E）體內(nèi)實驗中作者通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ABX組的腫瘤組織裂解物和血清中的IL6濃度增加，WesternBlot和免疫組織化學(xué)分析所示，p-p65和p-STAT3的表達也增加。（圖3F、G）以上結(jié)果表明在腸道通透性上調(diào)的情況下，腫瘤內(nèi)LPS升高，并激活了NF-κB-IL6-STAT3軸。
圖3
補充圖2
結(jié)果四：IL6-STAT3通路的激活促進前列腺癌生長和多西他賽耐藥IL6-STAT3 通路已被證實能夠促進多種惡性腫瘤的進展，并且與對多西他賽、5-氟尿嘧啶和其他臨床化療藥物的耐受性有關(guān)STAT3 下游增殖相關(guān)基因，如細胞周期蛋白 D1 和 c-myc，在 RM-1 和 DU-145 中都相應(yīng)改變（圖 4A）。同時，采用Edu檢測法和克隆形成法檢測前列腺癌細胞的體外增殖能力，結(jié)果表明抑制IL6-STAT3通路抑制了前列腺癌細胞株的增殖。（圖4B、C)體內(nèi)實驗中與Abx組相比，ABX STATTIC(STAT3磷酸化抑制劑)組腫瘤體積 (p < 0.001) 和重量顯著降低。(圖4D）腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析表明，與 NC 組相比，Abx 組的 p-STAT3、cyclin D1 和 c-myc 的表達增強，而 Abx Stattic 組的 p-STAT3、cyclin D1 和 c-myc的表達降低。（圖4E）
多西他賽作為前列腺癌的一線治療藥物，臨床上其潛在耐藥機制之一是激活IL6-STAT3通路。細胞活力和TUNEL分析表明，抑制IL6-STAT3途徑可改善前列腺癌細胞系對多西他賽的耐受性（圖5B、C）。體內(nèi)實驗進一步證實了這一結(jié)論。多西他賽顯著降低了正常喂養(yǎng)小鼠的腫瘤體積和重量，但未能降低腸道微生物群失調(diào)小鼠的腫瘤體積和重量。然而，多西他賽和Stattic聯(lián)合使用顯著減少了腫瘤體積和重量。（圖5D）腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析顯示，p-STAT3、Bcl-2和Survivin的表達也顯著減少（圖5E）。以上結(jié)果表明，IL6-STAT3通路在腸道微生物群失調(diào)小鼠的腫瘤中被激活，并促進前列腺癌的增殖和多西他賽化療耐藥性。
圖4
圖5
結(jié)果五：轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者腸道中變形菌門的相對豐度增加
上述結(jié)果表明，腸道微生物群失調(diào)促進小鼠前列腺癌的進展。然而，了解腸道微生物群對前列腺癌進展風(fēng)險的影響需要來自臨床患者樣本的進一步證據(jù)。作者選取良性前列腺增生（BPH，n=20），非轉(zhuǎn)移性前列腺癌(n = 10) 和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者 (n = 5) 進行后續(xù)探究。作者對來自患者的糞便樣本進行 16S rRNA 測序，發(fā)現(xiàn) α-和 β-多樣性在三組之間沒有顯著差異（圖 6A、B）。然而門水平的細菌組成表明，轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中變形菌門的相對豐度高于非轉(zhuǎn)移性前列腺癌或 BPH 患者，并且在前列腺癌和 BPH 患者之間也觀察到差異。（圖6C）接下來，作者對變形菌門與多個臨床參數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示變形菌門的相對豐度與血漿IL6水平、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和遠處轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)。（圖6D） 最后， ROC曲線顯示，盡管變形桿菌無法區(qū)分前列腺癌和 BPH，但它在預(yù)測遠處轉(zhuǎn)移方面的潛力要優(yōu)于 PSA 水平（在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中往往更高）。
圖6
研究結(jié)論
抗生素處理導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，特征為變形桿菌富集，進而使腸道通透性和瘤內(nèi)LPS升高，通過 NF-κB-IL6-STAT3 軸促進前列腺癌的發(fā)展。
校對：張丹
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