原文出處：Cheng C, Geng F, Li Z, Zhong Y, Wang H, Cheng X, Zhao Y, Mo X, Horbinski C, Duan W, Chakravarti A, Cheng X, Guo D. Ammonia stimulates SCAP/Insig dissociation and SREBP-1 activation to promote lipogenesis and tumour growth. Nat Metab. 2022 May;4(5):575-588. doi: 10.1038/s42255-022-00568-y. Epub 2022 May 9. PMID: 35534729; PMCID: PMC9177652.
研究背景：
脂質(zhì)是構(gòu)成質(zhì)膜和所有細(xì)胞器膜的基本結(jié)構(gòu)，因此獲得足夠的脂質(zhì)是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的先決條件。在生理?xiàng)l件下，脂質(zhì)水平主要由固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs)調(diào)控。SREBPs是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，包括SREBP-1a、-1c和-2三種亞型。SREBP-1c主要調(diào)控脂肪酸合成基因的表達(dá)，而SREBP-2調(diào)控膽固醇合成和攝取，SREBP-1a具有最高的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控所有過程。然而，SREBP-1在癌細(xì)胞中激活和脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。
SREBP作為非活性前體(125 kD)被合成并保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜中，并通過嚴(yán)格控制的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-細(xì)胞核過程被激活。SREBP與SCAP結(jié)合，然后被囊泡COPII包被并結(jié)合，將SCAP/ SREBP復(fù)合物從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基。在高爾基體中，SREBP被site-1和-2蛋白酶依次切割，釋放其n末端形式(約65kd)，然后進(jìn)入細(xì)胞核激活脂肪生成基因表達(dá)。然而，SCAP/SREBP復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)被駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白Insig所抑制，該蛋白包括兩個(gè)亞型，insg -1和-2。Insig與SCAP結(jié)合，保留SCAP/SREBP復(fù)合物在ER中。先前的研究表明，膽固醇或25-羥基膽固醇(25-HC)可以與SCAP或Insig結(jié)合，以增強(qiáng)它們的連接，從而介導(dǎo)一個(gè)負(fù)反饋回路，調(diào)節(jié)SREBP的激活。然而，激活SCAP從Insig中分離以實(shí)現(xiàn)后續(xù)易位的關(guān)鍵步驟尚不清楚。
在本研究中，作者的研究進(jìn)一步表明，靶向谷氨酰胺與糖脂代謝之間的關(guān)鍵分子鏈接是治療惡性腫瘤和代謝綜合征的一種有前景的策略。
研究結(jié)果：
結(jié)果一：SREBP激活和脂肪生成與谷氨酰胺密切相關(guān)
除了葡萄糖，癌細(xì)胞還消耗大量的谷氨酰胺，這是人類血液中最豐富的氨基酸，并需要大量的脂肪生成來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。谷氨酰胺、葡萄糖和脂質(zhì)合成之間是否存在內(nèi)在的分子聯(lián)系尚不清楚。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者首先在肺癌H1299細(xì)胞中使用RNA測(cè)序進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。作者發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和葡萄糖都不能單獨(dú)激活調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇合成和攝取的基因的表達(dá)，包括SREBF1、SREBF2、ACLY、ACACA、FASN、SCD1、HMGCR和LDLR。但值得注意的是，脂肪生成基因的激活需要谷氨酰胺和葡萄糖的同時(shí)存在，但SCAP基因的表達(dá)既不受谷氨酰胺也不受葡萄糖的影響(圖1a)，這些結(jié)果可以通過PCR的驗(yàn)證(圖1b)。接下來，作者使用多種癌細(xì)胞系研究了是否需要谷氨酰胺來激活SREBP。Western blot分析顯示，單獨(dú)使用葡萄糖不能激活SREBP-1和SREBP-2的裂解(圖1c)。SREBP-1的兩個(gè)關(guān)鍵下游靶點(diǎn)脂肪酸合成酶(FASN)和硬脂酰輔酶a去飽和酶-1 (SCD1)的表達(dá)也不能被葡萄糖單獨(dú)激活(圖1c)。只有谷氨酰胺和葡萄糖聯(lián)合作用才能強(qiáng)烈誘導(dǎo)SREBP-1和-2的裂解，以及其N-或c -末端產(chǎn)物顯著增加，F(xiàn)ASN和SCD1表達(dá)上調(diào)(圖1c)。接下來，作者想要探究谷氨酰胺的缺乏是否通過影響SCAP蛋白的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致SREBPs失活。western blot分析，細(xì)胞核提取物中的SREBP-1 的n端表明，葡萄糖缺失導(dǎo)致SCAP降解和SREBP-1裂解失活(圖1d)。與谷氨酰胺和葡萄糖同時(shí)存在時(shí)相比，當(dāng)有葡萄糖存在時(shí)，去除谷氨酰胺對(duì)SCAP蛋白水平?jīng)]有影響(圖1d);然而，讓人感興趣的是，在谷氨酰胺缺失的情況下，作者無法在核提取物中檢測(cè)到任何活性的n端SREBP-1(圖1d)。免疫熒光染色證實(shí)，除非谷氨酰胺和葡萄糖同時(shí)存在，否則SREBP-1無法移動(dòng)到核中(圖1e)。作者還檢測(cè)了表達(dá)GFP-SCAP的HEK293T細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下的SCAP n -糖基化。數(shù)據(jù)顯示，在葡萄糖存在的情況下，去除谷氨酰胺對(duì)SCAP n -糖基化沒有影響(圖1f)，以及GFP-SCAP蛋白水平也一樣(圖1f)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，只有葡萄糖可以介導(dǎo)的SCAP n -糖基化和SCAP的穩(wěn)定性，但葡萄糖不能單獨(dú)激活SREBPs和在谷氨酰胺存在時(shí)的脂肪生成，這表明存在一個(gè)重要的內(nèi)在分子鏈接，將谷氨酰胺和葡萄糖與脂質(zhì)代謝聯(lián)系起來。
結(jié)果二：谷氨酰胺釋放的氨激活SREBPs和脂肪生成
眾所周知，谷氨酰胺分解在許多癌癥中都是高度激活的。在這個(gè)過程中，谷氨酰胺首先被谷氨酰胺酶(GLS)脫氨釋放氨(NH3)，并產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-KG)，進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)以產(chǎn)生能量。通過Bioprofile 100 Plus Analyzer，檢測(cè)了H1299和U87細(xì)胞在無糖有谷氨酰胺存在下培養(yǎng)的培養(yǎng)基，作者檢測(cè)到NH3(在水溶液中轉(zhuǎn)化為NH4 )和谷氨酸。NH3和NH4 被稱為氨。相比之下，當(dāng)細(xì)胞在葡萄糖存在但不含谷氨酰胺的條件下培養(yǎng)時(shí)，檢測(cè)到乳酸鹽和谷氨酸鹽(圖2a)。谷氨酰胺與葡萄糖結(jié)合時(shí)，檢測(cè)到NH4 /谷氨酸/乳酸三種代謝物(圖2a)。然后作者檢查了哪些代謝產(chǎn)物參與了SREBP的激活。Western blot分析顯示，谷氨酸、氨(來自于添加的NH4Cl)或乳酸均不能單獨(dú)激活SREBP-1或-2的切割以及促進(jìn)FASN和SCD1的表達(dá)(圖2b)。相反，在葡萄糖存在下，氨誘導(dǎo)SREBP-1和-2分裂，以及FASN和SCD1的表達(dá)，與谷氨酰胺和葡萄糖聯(lián)合作用的程度相似(圖2b)。添加的NH4Cl溶液的作用是劑量和時(shí)間依賴性的(圖2c, d)。免疫熒光成像進(jìn)一步顯示，在葡萄糖存在的情況下，氨顯著刺激SREBP-1易位進(jìn)入細(xì)胞核(圖2e)。H1299細(xì)胞的RNA測(cè)序分析證實(shí)，氨與谷氨酰胺類似，與葡萄糖相比，氨顯著激活了控制脂肪酸和膽固醇合成通路的基因的表達(dá)(圖2f)，實(shí)時(shí)PCR進(jìn)一步證實(shí)的一致（圖2g)。作者進(jìn)一步研究了氨是否影響了葡萄糖調(diào)節(jié)的SCAP的穩(wěn)定性和n -糖基化。Western blot分析顯示，與葡萄糖單獨(dú)作用相比，在葡萄糖存在下，氨對(duì)SCAP蛋白和n -糖基化水平均無影響(圖2h, i)，但氨顯著激活SREBP-1和-2的裂解并增加FASN和SCD1表達(dá)(圖2h)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，谷氨酰胺釋放的氨是SREBP激活和脂肪生成的關(guān)鍵激活因子。
結(jié)果三：抑制谷氨酰胺的分解會(huì)抑制SREBP的激活
接下來，作者驗(yàn)證了谷氨酰胺釋放的氨在刺激SREBP激活和脂肪生成中的作用。作者用γ-谷氨酰對(duì)硝基苯胺(GPNA)抑制谷氨酰胺攝取（它是一種主要的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC1A5(也稱為ASCT2)的抑制劑)并用CB-839（一種谷氨酰胺酶(GLS)抑制劑）阻斷谷氨酰胺分解。代謝物分析顯示，GPNA和CB-839處理均顯著降低了細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中谷氨酸、氨和α-KG的水平(圖3a)。這兩種抑制劑都能顯著抑制谷氨酰胺刺激的SREBP激活和FASN和SCD1的表達(dá)(圖3b)。然后，作者在細(xì)胞中添加氨(添加NH4Cl的溶液)、谷氨酸或α-KG，以確定哪種代謝物能夠恢復(fù)CB-839抑制的SREBP激活。Western blot分析顯示，只有添加氨(添加NH4Cl的溶液)的組能明顯恢復(fù)SREBP激活和FASN/SCD1表達(dá)(圖3c)。免疫熒光成像顯示，CB-839阻斷了SREBP-1的細(xì)胞核易位，通過添加氨可以成功恢復(fù)，但加入谷氨酸無法修復(fù)(圖3d)。作者還利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA抑制GLS，以從遺傳學(xué)抑制谷氨酰胺的氨釋放。GLS敲低顯著降低谷氨酰胺消耗，抑制谷氨酸、氨和α-KG的生產(chǎn)(圖3e)，并明顯抑制SREBP的激活和FASN/SCD1的表達(dá)(圖3f)。補(bǔ)充氨，而不是谷氨酸或α-KG，顯著恢復(fù)了SREBP的激活和FASN ，SCD1的表達(dá)(圖3g)。SREBP-1核易位的免疫熒光成像也可以證實(shí)(圖3h)。GLS 的藥理學(xué)和遺傳抑制也明顯減少了核提取物中 SREBP-1 N 末端形式的出現(xiàn)（圖 3i），而它們沒有改變 SCAP 蛋白和 N-糖基化水平（圖 3i-k）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，氨從谷氨酰胺釋放激活SREBP和脂肪生成，揭示了通過谷氨酰胺- GLS -氨- SREBP激活軸，谷氨酰胺分解和脂肪生成連接在一起。
結(jié)果四：人類腫瘤中，GLS和SREBP-1有高度相關(guān)性
接下來作者檢查谷氨酰胺分解和脂肪生成之間的聯(lián)系是否可以在人體中得到驗(yàn)證。作者首先用western blot方法分析了7對(duì)配對(duì)的腫瘤與相鄰的正常人類肺組織，這些組織來自于腺癌、鱗狀和大細(xì)胞肺癌患者。數(shù)據(jù)顯示，與相鄰的正常肺組織相比，7個(gè)腫瘤組織均高水平表達(dá)GLS, SREBP-1，切割后的N-SREBP，而且FASN蛋白顯著增加(圖4a)。然后作者檢查了多個(gè)石蠟包埋的腫瘤與相鄰的正常肺組織，免疫組化染色顯示，腫瘤組織(T)中GLS的表達(dá)以及胞質(zhì)和核SREBP-1的染色程度明顯升高，而相鄰正常組織(N)中兩者的染色均較低(圖4b)。然后，作者用氨檢測(cè)試劑盒測(cè)量10對(duì)肺組織的氨水平。與GLS表達(dá)和SREBP-1激活的升高一致(圖4a, b)，數(shù)據(jù)顯示腫瘤中氨水平顯著高于配對(duì)正常組織(圖4c)。接下來，作者檢測(cè)了一個(gè)包含99個(gè)腫瘤和50個(gè)匹配的相鄰正常肺組織的組織芯片(TMA)，這些組織來自不同類型的肺癌患者。免疫組化染色顯示，與相鄰正常肺組織相比，90%以上的肺腫瘤組織中GLS的水平較高，而且SREBP-1染色較明顯(圖4d, e)。Pearson相關(guān)性分析顯示，GLS的表達(dá)與SREBP-1的染色程度密切相關(guān)(圖f)。作者還檢查了多個(gè)GBM組織和91個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本的TMA。免疫組化染色顯示，在低至高級(jí)別膠質(zhì)瘤的腫瘤組織中，GLS高表達(dá)和SREBP-1強(qiáng)染色是相關(guān)的(圖4g-j)。Kaplan-Meier圖分析進(jìn)一步顯示，GLS表達(dá)更高和SREBP-1染色更強(qiáng)伴隨著GBM患者生存更差(圖4k)?？傊?，這些大型臨床樣本分析表明，在人類癌癥中，GLS表達(dá)與SREBP-1激活顯著相關(guān)，為生理?xiàng)l件下谷氨酰胺分解和脂肪生成之間的分子聯(lián)系提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。
結(jié)果五：氨結(jié)合SCAP，并將其從Insig中分離出來
由于谷氨酰胺和氨都不影響SCAP的穩(wěn)定性和n -糖基化(見圖1d、f和圖2h、i)，作者想知道它們是否參與了SCAP/Insig的解離，從而促進(jìn)SREBP的激活(圖5a)。作者在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染GFP-SCAP和Myc標(biāo)記的Insig-1 (Myc-Insig-1)，然后在葡萄糖存在下用谷氨酰胺或氨(NH4Cl)培養(yǎng)這些細(xì)胞。聯(lián)合免疫沉淀(co-IP)試驗(yàn)和western blot分析顯示，與單獨(dú)使用葡萄糖相比，谷氨酰胺或氨大幅度降低了SCAP和Insig-1的相關(guān)性(圖5b)。共聚焦顯微鏡成像顯示谷氨酰胺或氨刺激GFP-SCAP轉(zhuǎn)移到高爾基體（GFP-SCAP與Giantin(紅色)共定位，Giantin是一種高爾基體蛋白標(biāo)記物）(圖5c)。相比之下，CB-839抑制GLS則完全恢復(fù)了SCAP與Insig-1的結(jié)合，如圖co-IP所示(圖5d)。共聚焦顯微鏡成像進(jìn)一步顯示，GLS的抑制消除了谷氨酰胺促進(jìn)的GFP-SCAP向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，而通過添加氨則可以完全恢復(fù)了這一轉(zhuǎn)運(yùn)(圖5e)，表明谷氨酰胺釋放的氨刺激SCAP從Insig解離，從而觸發(fā)其轉(zhuǎn)運(yùn)。為了闡明氨與SCAP的相互作用，作者利用SCAP/Insig跨膜域的低溫電鏡，以及利用共溶劑分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬來繪制SCAP中潛在的氨結(jié)合位點(diǎn)。有趣的是，當(dāng)25-HC缺失時(shí)，NH4 ，而不是NH3，被發(fā)現(xiàn)占據(jù)了靠近SCAP S6螺旋的跨膜區(qū)域的一個(gè)大球體(圖5f)。作者仔細(xì)檢查了這個(gè)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它是由3個(gè)關(guān)鍵殘基形成的:來自S6螺旋的天冬氨酸D428，來自S3螺旋的絲氨酸S326和S330(圖5g)。值得注意的是，D428和S326/S330是SCAP中進(jìn)化高度保守的殘基。NH4 在整個(gè)模擬過程中與D428、S326和S330側(cè)鏈形成穩(wěn)定的氫鍵，其親合力為:D428 >> S330 > S326(圖5g)。Western blot分析證實(shí)了這些結(jié)合預(yù)測(cè)，表明將帶負(fù)電荷的天門冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹行员彼?D428A)，則會(huì)完全消除NH4 或谷氨酰胺對(duì)SREBP-1激活的刺激。S330A 突變體輕微降低了 SREBP-1 的激活，而 S326A/S330A 雙突變體則明顯降低了它（圖 5h）。相比之下，當(dāng)纈氨酸 353(從S4螺旋)突變?yōu)楦拾彼?V353G)時(shí)，SREBP-1的激活沒有影響(圖5g, h)。作者在從細(xì)胞膜純化這些蛋白后，比較了氨結(jié)合GFP-SCAP野生型(wt)和其D428A突變體(圖5i, j)。結(jié)果表明，氨結(jié)合GFP-SCAP野生型(wt)的水平比對(duì)照GFP蛋白高約2倍，而D428A突變體則抑制了結(jié)合，使氨結(jié)合水平恢復(fù)到對(duì)照GFP蛋白的水平(圖5j)。接下來，作者研究了D428A突變是否可以消除谷氨酰胺和氨引起的SCAP從Insig的分離。Co-IP數(shù)據(jù)顯示，D428A突變破壞了谷氨酰胺和氨介導(dǎo)的SCAP從Insig-1的解離激活(圖5k)。因此，谷氨酰胺或氨刺激的GFP-SCAP向高爾基體的轉(zhuǎn)移也被D428A突變所抑制(圖5l)。此外，與野生型SCAP轉(zhuǎn)染相比，D428A突變阻斷了谷氨酰胺和氨促進(jìn)的SREBP-1a、-1c和-2的激活(圖5m)，突出了D428對(duì)氨刺激的重要性?？傊?，氨通過與D428、S326和S330殘基的相互作用，誘導(dǎo)SCAP跨膜結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，從而刺激SCAP從Insig中分離，最終導(dǎo)致SCAP/SREBP易位和活化。D428A 突變抑制了氨與 SCAP 的結(jié)合，因此即使在低甾醇條件下也能保持與 Insig 的結(jié)合。
結(jié)果六：破壞氨- SCAP相互作用可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)
接下來，作者通過將SCAP中的D428轉(zhuǎn)化為丙氨酸(D428A)來干擾氨與SCAP的相互作用是否會(huì)影響腫瘤的生長(zhǎng)。將GFP、GFP- SCAP野生型或D428A突變體轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的H1299肺癌細(xì)胞中。Western blot分析顯示，野生型SCAP顯著增加了SREBP-1和SREBP -2的切割及成熟，而D428A突變則抑制了這種切割(圖6a)。這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被植入小鼠體內(nèi)。與對(duì)照組GFP組相比，GFP- SCAP野生型植入后50天，發(fā)現(xiàn)顯著增加了肺區(qū)域的腫瘤生長(zhǎng)，而D428A突變消除了這種增長(zhǎng)(圖6b, c)。肺大體圖像顯示，GFP- SCAP野生型組肺表面的腫瘤病變數(shù)量高于GFP和D428A突變組(圖6d)。H&E染色證實(shí)，GFP- SCAP野生型組肺部腫瘤病變數(shù)量顯著增加(圖6d, e,)。免疫組化染色顯示，與GFP組相比，GFP- SCAP野生型組肺腫瘤組織中SREBP-1水平顯著升高，而這種升高會(huì)被D428A的突變消除掉(圖6d, e)。作者用原代GBM30細(xì)胞重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)(圖6f) 。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GBM細(xì)胞植入小鼠大腦，通過磁共振成像(MRI)檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。影像學(xué)顯示，GFP- SCAP野生型組的腫瘤體積顯著大于對(duì)照組GFP和D428A突變組(圖6g)。H&E染色證實(shí)各組第17天的腫瘤大小與MRI檢查結(jié)果一致(圖6h)。免疫組化染色顯示，GFP- SCAP野生型組的SREBP-1染色明顯強(qiáng)于其他兩組(圖6h, i)。此外，植入GFP- SCAP野生型表達(dá)細(xì)胞的小鼠的生存時(shí)間明顯短于其他兩組(圖6j)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，通過突變D428殘基來破壞氨與scap的相互作用，可以顯著抑制SREBP-1的激活和腫瘤的生長(zhǎng)。
研究結(jié)論：
1.SREBP的激活和脂肪的生成與谷氨酰胺密切相關(guān)，谷氨酰胺釋放的氨可以激活SREBPs和脂肪生成
2.人類腫瘤中，GLS和SREBP-1有高度相關(guān)性。抑制谷氨酰胺的分解會(huì)抑制SREBP的激活
3.氨結(jié)合SCAP，并將其從Insig中分離出來
4.破壞氨- SCAP相互作用可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)
校對(duì)：王鈺雄
聯(lián)系客服
