1 背景知識(shí)介紹
1.1 qRT-PCR原理與應(yīng)用
實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR (Real-Time
Quantitative Reverse Transcription PCR)是PCR技術(shù)的一項(xiàng)重大發(fā)展，它能夠?qū)?/span>PCR過(guò)程中每個(gè)周期產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行可靠的檢測(cè)和定量檢測(cè)。在引入寡核苷酸探針（qPCR引物）后，使得這種技術(shù)成為可能，寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)用于在目標(biāo)序列內(nèi)雜交。由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性，在PCR過(guò)程中探針的切割可以用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增 。
1.2 qRT-PCR反應(yīng)
qRT-PCR反應(yīng)主要包含四步：首先是雙鏈cDNA結(jié)合染料的嵌入；其次是32P探針的標(biāo)記；接著是用熒光染料標(biāo)記探針；最后是記錄熒光值。
這里主要是運(yùn)用到Taqman實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該方法利用taqdna聚合酶的5'端內(nèi)切酶活性，在PCR過(guò)程中切割寡核苷酸探針，從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。探針在其5'端被熒光標(biāo)記，并且在其3'端通過(guò)化學(xué)修飾不可擴(kuò)展。
（圖2 qRT-PCR檢測(cè)基本原理圖）
1.3 qRT-PCR專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)（Nomenclature）解讀
基線(xiàn)（Baseline）：被定義為PCR周期，其中報(bào)告熒光信號(hào)正在積累，但低于儀器的檢測(cè)極限。
ΔRn（時(shí)間點(diǎn)熒光增量）：是每個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光信號(hào)的增量，ΔRn值與循環(huán)數(shù)關(guān)系（S型）。
閾值（Threshold）是根據(jù)基線(xiàn)可變性選擇的任意熒光水平，檢測(cè)到高于閾值的信號(hào)被認(rèn)為是實(shí)信號(hào)，可用于定義樣本的閾值周期(Cycle threshold, Ct)。閾值可以對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，使其在所有圖中都處于指數(shù)放大區(qū)域。
閾值周期（Cycle threshold, Ct）是定義為報(bào)告熒光大于閾值的分?jǐn)?shù)PCR循環(huán)數(shù)。Ct是實(shí)時(shí)PCR的基本原理，是產(chǎn)生準(zhǔn)確和可重復(fù)數(shù)據(jù)的重要組成部分（相對(duì)表達(dá)量的直接數(shù)值，可以認(rèn)為是最關(guān)鍵數(shù)值，平時(shí)大家在qRT-PCR中直接關(guān)注的數(shù)值）。
（圖3 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR工作示意圖）
2 定量qRT-PCR實(shí)操
2.1 qRT-PCR布板
我們以96孔板，6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，4個(gè)基因，內(nèi)參以β-Actin為例進(jìn)行布板：
表1 qRT-PCR布板
2.2 qRT-PCR上樣
qRT-PCR加樣的體系具體參考試劑公司提供的SYBR qRT-PCR提供的試劑說(shuō)明書(shū)，但是我們一般要準(zhǔn)備的是引物（上游引物 &下游引物）以及cDNA模板和ddH2O,在此我們以SYBR mix，10 μL體積為例進(jìn)行加樣。
表2 SYBR Mix qRT-PCR加樣體系
2.3 qRT-PCR上機(jī)
qRT-PCR的擴(kuò)增程序類(lèi)似與RT-PCR，主要包含變性-退火-延伸三步，qRT-PCR特殊的一點(diǎn)是在延伸（退火/延伸-兩步法糅合在一起）進(jìn)行了熒光數(shù)據(jù)的采集，以及多了最后一步的溶解曲線(xiàn)數(shù)據(jù)采集（儀器默認(rèn)設(shè)置）。
表3 qRT-PCR擴(kuò)增程序
2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算
qRT-PCR的數(shù)據(jù)計(jì)算通用規(guī)則是2^-△△Ct計(jì)算規(guī)則|：
即：△Ct=Gene Ct – β-Actin Ct；
△△Ct=△Ct - 參考△Ct（一般選擇對(duì)照組△Ct為參考）
下邊以一個(gè)對(duì)照組和一個(gè)處理組（Treat），使用Excel進(jìn)行計(jì)算為例
表4 qRT-PCR定量數(shù)據(jù)處理
表中數(shù)據(jù)解釋?zhuān)?/span>
Gene
Ct即基因采集到的循環(huán)閾值，有的儀器上顯示Cq（q前邊原理以講解），β-Actin原理與Gene Ct一樣；△Ct=gene Ct -β-Actin Ct；參考△Ct=NC △Ct均值；△△Ct=△Ct- 參考△Ct；相對(duì)表達(dá)量即2^-△△Ct：Excel輸入方法“=power（2，-△△Ct）”(注意數(shù)值就是G列數(shù)值取負(fù)數(shù))或輸入“=2^-△△Ct”，^是輸入法在英文狀態(tài)下同時(shí)按住shift 6（6的上邊就有^）即可；
t-test：在這里采用的非配對(duì)t檢驗(yàn)，Excel輸入方法：
選擇檢驗(yàn)函數(shù)：找到excel的函數(shù)fx（BCC處），然后選擇 “TTEST”（圖4紅框標(biāo)記）。
（圖4 excel中t-test檢驗(yàn)的選擇方式）
（圖5 選擇需要選擇檢驗(yàn)的兩組數(shù)據(jù)。F3:F8是對(duì)照組，F9:F14是處理組，tails=2表示雙尾，即不知道顯著性的情況下，type=2一般我理解為非配對(duì)的t檢驗(yàn)?zāi)Ｊ剑?dāng)然圖中也有注解）
t-test檢驗(yàn)數(shù)值=
，即小于0.05，兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.5 圖形化數(shù)據(jù)
這里就不再講解了，常規(guī)作圖，1直接使用Excel；2使用origin；3使用GrapdhPAD。
2.6 結(jié)束。
（愛(ài)自己?。?！做科研!!! 每文格言“村上春樹(shù)曾在書(shū)里寫(xiě)道：'不管全世界所有人怎么說(shuō)，我都認(rèn)為自己的感受才是正確的，無(wú)論別人怎么看，我絕不打亂自己的節(jié)奏，喜歡的事自然可以堅(jiān)持，不喜歡的怎么也長(zhǎng)久不了。”如果有用，關(guān)注樓主GBhouse，點(diǎn)贊 討論是博主持續(xù)更新的動(dòng)力?。。。?/span>
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