lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而大量研究表明，lncRNA在細(xì)胞核內(nèi)、核外，通過染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
lncRNA功能研究的基本思路
一般來說，lncRNA功能研究的主線包含3個主要步驟：
（1）高通量篩選。全轉(zhuǎn)錄組測序和lncRNA芯片是目前最常用的技術(shù)手段，通過這種高通量的篩選方法，可以快速獲得不同實驗組間差異表達(dá)的lncRNA和mRNA。
（2）候選lncRNA的確定。通過生物信息學(xué)分析，從大量lncRNA 中篩選有潛在功能意義的lncRNA。
（3）目標(biāo)lncRNA的功能分析與驗證。根據(jù)上述生物信息分析推斷出lncRNA可能的生物學(xué)功能，并設(shè)計相應(yīng)的實驗來驗證假設(shè)是否成立。
lncRNA研究的基本流程
LncRNA的一般研究策略
1. lncRNA篩選
通過lncRNA芯片或RNA測序等方法對多對疾病模型和對照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析；通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA，預(yù)測lncRNA的靶基因，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；通過PCR或Northern Blot技術(shù)對候選lncRNA驗證，確定其表達(dá)差異。
lncRNA篩選建議
根據(jù)統(tǒng)計學(xué)篩選，比如fold-change和p-value，同時表達(dá)量高的
根據(jù)lncRNA在基因組上的位置進(jìn)行篩選
根據(jù)lncRNA的靶基因進(jìn)行篩選，篩選和表型相關(guān)的lncRNA
根據(jù)lncRNA與mRNA在表達(dá)上的協(xié)同關(guān)系進(jìn)行推斷，篩選具有hub地位的lncRNA
根據(jù)lncRNA與protein的關(guān)系進(jìn)行篩選
根據(jù)lncRNA與miRNA的靶向關(guān)系篩選
2. lncRNA全長克隆
可以通過5'RACE獲取lncRNA 5'全長，3'RACE獲取lncRNA 3'全長，最終拿到完整的lncRNA序列。
3. lncRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位
通過FISH原位雜交技術(shù)定位，或者通過細(xì)胞核質(zhì)分離試劑盒得到RNA，qRT-PCR檢測其分布。如果是核內(nèi)，那么，接下來考慮的作用方式可以就是染色質(zhì)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控（結(jié)合到啟動子區(qū)，和某些轉(zhuǎn)錄因子互作，Pol II的抑制子……）；如果是核外，那么，考慮的作用方式可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（影響mRNA的穩(wěn)定性，影響mRNA翻譯，作為miRNA的”sponge”……）。此外，一些數(shù)據(jù)庫比如RNALocate也可以幫助我們了解lncRNA的定位信息。
4. lncRNA的功能研究
lncRNA較長，承載的信息量多，更容易形成高級結(jié)構(gòu)，其功能具有多樣化和特異性強(qiáng)的特點。類似于miRNA，探討lncRNA功能可用gain/loss of function 策略，過表達(dá)或沉默lncRNA后觀察表型。即研究lncRNA功能獲得后或者功能缺失后對細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移與克隆形成，以及病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制等的影響。
（1）功能獲得性研究
構(gòu)建lncRNA過表達(dá)質(zhì)粒或者慢病毒、腺病毒包裝載體。原則上是將全長lncRNA定向克隆到表達(dá)載體上實現(xiàn)lncRNA的過表達(dá)。然而有些lncRNA很大或全長尚未分離，這時將視lncRNA在基因組上的定位采取不同的研究策略。在構(gòu)建 lncRNA表達(dá)質(zhì)粒時，需關(guān)注lncRNA是否在蛋白編碼基因的啟動子區(qū)域或3′-UTR區(qū)域，勿遺漏重要區(qū)段。
（2）功能缺失性研究
可用siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9等方法沉默lncRNA，經(jīng)qRT-PCR或 FISH等驗證后觀察其對疾病相關(guān)基因表達(dá)和對細(xì)胞表型等的影響。
5.機(jī)制研究
lncRNA可與蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA 相互作用，但是目前最常用的還是利用體外轉(zhuǎn)錄、RNA pull down、RNA-RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）、CHIRP-seq（Chromatin isolation by RNA Purification）、MS 等技術(shù)手段。
6.表達(dá)調(diào)控
將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋其調(diào)控機(jī)理。
DNA甲基化和乙?；嚎赏ㄟ^檢測相應(yīng)基因甲基化、乙?；町惻clncRNA結(jié)合分析。
轉(zhuǎn)錄因子：研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。
7.體內(nèi)驗證
有條件的實驗室，可以繼續(xù)在體內(nèi)或者臨床樣本水平進(jìn)行驗證。
lncRNA的作用機(jī)制不清楚，lncRNA的功能非常難研究。當(dāng)前很多通過研究miRNA 與lncRNA的調(diào)控關(guān)系來揭示非編碼RNA的功能，最熱門的要數(shù)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。相關(guān)的可利用資源包括：
starBase平臺構(gòu)建了最全面的CLIP-Seq實驗支持的miRNA和lncRNA的調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，包括構(gòu)建了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。
DIANA-LncBase數(shù)據(jù)庫只是構(gòu)建了基于單個CLIP-Seq數(shù)據(jù)的miRNA和lncRNA 調(diào)控關(guān)系。
LncRNA的一般研究實驗手段
1.與蛋白質(zhì)的相互作用
識別lncRNA的蛋白質(zhì)伙伴，可以為它們的功能的機(jī)制和路徑提高線索。RIP技術(shù)，如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)、UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗體來pulldown核蛋白復(fù)合物，然后從中分離相關(guān)RNA用于分析。每個變體都有它各自的優(yōu)勢和缺陷。nRIP提供交聯(lián)產(chǎn)物，而CLIP在避免交聯(lián)產(chǎn)物的重新組合的同時用于識別RNA與蛋白質(zhì)相互作用位點。這些技術(shù)可以結(jié)合高通量測序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，來識別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質(zhì)因子，盡管還需要技術(shù)手段的確認(rèn)。
2.與DNA的相互作用
有幾個實驗技術(shù)被用于識別lncRNA的基因組靶位點。以染色體免疫共沉淀（ChIP）和RIP技術(shù)的原理為基礎(chǔ)，使用染色體RNA免疫共沉淀（ChRIP）來識別與特殊染色體標(biāo)簽相互作用的RNA。另一方面，chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)、capture hybridization of RNA targets (CHART)使用標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸來識別與目的RNA相互作用的DNA位點。
3.結(jié)構(gòu)特征
lncRNA可以形成特殊的二級和三級結(jié)構(gòu)來執(zhí)行它們的功能。通過selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)和in-line probing來獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，連接其它依賴于RNA酶消化的技術(shù)，如fragmentation sequencing (FragSeq)和parallel analysis of RNA structure (PARS)。
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