九色国产,午夜在线视频,新黄色网址,九九色综合,天天做夜夜做久久做狠狠,天天躁夜夜躁狠狠躁2021a,久久不卡一区二区三区

在這個飛速發(fā)展的測序時代，DNA和RNA測序已經(jīng)逐漸成為“實驗室中的家常菜”。若要評選出目前最受歡迎的一道菜，那恐怕非單細胞RNA測序莫屬。

以往，研究人員通常利用RNA測序（RNA-seq）來檢測樣本中的所有RNA轉(zhuǎn)錄本，以發(fā)現(xiàn)新型RNA，或開展基因表達分析。不過，測序的對象往往是組織樣本或細胞群，這使得細胞之間的差異有可能被平均值所掩蓋。

作為獨一無二的個體，細胞寶寶也許并不樂意自己的光芒被掩蓋。于是，單細胞測序應(yīng)運而生。自2013年被《Nature Methods》評為年度技術(shù)以來，這項技術(shù)正被迅速地采用，發(fā)表文獻的數(shù)量也在逐年遞增。

單細胞RNA-seq能夠獨立地提供每個細胞的RNA表達譜，并鑒定異質(zhì)細胞群中的稀有細胞。盡管腫瘤異質(zhì)性可歸因于累積突變，但即使是遺傳上相同的細胞在相同環(huán)境下也可能表現(xiàn)出基因和蛋白表達水平的差異，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。單細胞RNA-seq就能夠發(fā)現(xiàn)這些稀有個體。

單細胞RNA-seq的流程

當然，單細胞RNA-seq的開展絕非易事，需要用到一系列尖端技術(shù)。大家首先要高效分離單細胞，然后進行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、文庫制備和測序，最后再通過生物信息學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。其中，第一步 – 單細胞分離就相當棘手。

單細胞分離

從異質(zhì)性的細胞群體中分離單細胞，目前的選擇有不少，新方法也在不斷面世。選擇分離方法時，您可能需要考慮它是高通量還是低通量，以及是盲選還是有偏向的選擇（基于某個參數(shù)）。

一些高通量的技術(shù)，比如最常用的熒光激活細胞分選（FACS）和磁性激活細胞分選（MACS），可根據(jù)細胞的大小/形狀或細胞表面標志物的表達進行有偏向的選擇，而基于微流體和液滴的技術(shù)可實現(xiàn)細胞的無偏向分離，如Fluidigm C1和10x Genomics Chromium系統(tǒng)（微流體）以及Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator（液滴）。不過，需要注意的是，組織/細胞的解離過程可能會改變RNA的表達譜。

若對通量要求不高，可選擇在顯微鏡下手動挑選細胞，或采用激光捕獲顯微切割（LCM），這些是基于細胞形態(tài)或熒光報告基因表達的有偏向選擇，好處在于您可以了解單細胞所處的環(huán)境和它們以前的鄰居，缺點是您需要特別小心，以免切到細胞或細胞核。相比之下，細胞的有限稀釋就是無偏向的。

圖1. 細胞分離方法一覽

RNA-Seq方案

標準的文庫制備方案適用于10-100 ng的DNA起始材料。然而，單個細胞平均只含有10 pg的總RNA。因此，RNA提取和文庫制備的流程必須經(jīng)過調(diào)整和優(yōu)化，才能用于單細胞材料。

首先，需要裂解分離出的單細胞，以獲得RNA。這個步驟可通過自動化設(shè)備完成，如上文提到的Fluidigm C1、10x Genomics Chromium和Bio-Rad ddSEQ Single-Cell Isolator，也可利用市售試劑盒來手動完成，如Thermo Scientific Single Cell Lysis Kit。當然，細胞裂解和RNA純化的操作可同時進行，只需選擇您中意的試劑盒。

然后，大多數(shù)方案是通過polyA選擇來富集mRNA，并利用經(jīng)過修飾的oligo dT引物來進行逆轉(zhuǎn)錄。在逆轉(zhuǎn)錄的過程中，有些方案利用獨特分子標識符（UMI）對單分子進行標記，這些是隨機的六核苷酸，可以更精確地定量單細胞中mRNA分子的初始量。之后，通過體外轉(zhuǎn)錄或PCR擴增cDNA，然后將擴增好的cDNA文庫用于文庫制備和高通量測序。

PCR方法的優(yōu)點在于能夠產(chǎn)生全長cDNA。不過，對于不同片段（如GC含量較高），PCR的效率可能不同，導(dǎo)致文庫的覆蓋度不均勻。另一方面，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的文庫能夠避免PCR的序列偏向，但有些序列的轉(zhuǎn)錄效率低，導(dǎo)致序列drop-out或不完整。

許多方案采用的都是Nextera文庫制備，并在Illumina的測序平臺上開展。Illumina的一整套測序產(chǎn)品組合都適用于單細胞測序，具體取決于實驗的類型和規(guī)模。例如，NovaSeq 6000支持大規(guī)模的研究，而NextSeq 500特別適合小型實驗室。

早在2009年，湯富酬教授等人開發(fā)出第一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)mRNA-Seq。之后，許多新穎的技術(shù)被開發(fā)出來，可以更快速、更低成本地提供更多信息。我們早前回顧了一些熱門的單細胞RNA-seq方法，包括SMART-seq & SMART-seq2、CEL-seq、Drop-seq和inDrop。同時，新方法還在不斷涌現(xiàn)。

2016年，Broad研究所的研究人員在《Science》上發(fā)表了一種稱為sNuc-Seq的單核RNA測序方法。這種新方法適用于大腦等復(fù)雜組織，避免分離過程影響RNA含量。它利用從細胞中提取出的單個細胞核作為起始材料，獲取基因表達譜。可惜，該方法的通量并不高，主要在96孔或384孔板上開展。

為了實現(xiàn)更大規(guī)模的研究，Broad研究所的團隊轉(zhuǎn)向了微流體。他們受Drop-Seq方法的啟發(fā)，將單細胞與帶有DNA條碼的微珠一起包裹在微滴中，以便大大加速實驗進程，同時降低成本。2017年，他們開發(fā)出DroNc-Seq方法，并發(fā)表在《Nature Methods》上，也引起廣泛關(guān)注。

數(shù)據(jù)分析

由于每個單細胞都是獨特的，不可能開展重復(fù)實驗并評估噪音。因此，必須采取一些質(zhì)量控制手段，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。專家建議，向每個細胞裂解液中加入已知序列和數(shù)量的合成mRNA，如外源RNA對照聯(lián)盟（ERCC）開發(fā)的加標RNA。這些RNA的讀數(shù)將提供樣本間差異的信息。

總的來說，單細胞水平的轉(zhuǎn)錄組分析可以揭示細胞群體中的細胞異質(zhì)性，強調(diào)了個別細胞的與眾不同。此外，同時分析多種分子（如DNA、RNA和蛋白質(zhì)）的方法也不斷被開發(fā)出來。這種更全面的單細胞組圖有望進一步加深我們對生物學(xué)過程的了解，對未來的科研及臨床研究大有裨益。（生物通 薄荷）