免疫治療在肝細(xì)胞肝癌的治療中已經(jīng)進(jìn)入了一線治療的行列，T+A方案有效的延長(zhǎng)了晚期肝癌的生存時(shí)間，中位生存時(shí)間首次達(dá)到2年的期限，實(shí)現(xiàn)了晚期肝癌治療的新突破。以免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表免疫治療僅僅是非特異性的免疫治療其中之一，免疫治療還包括特異性的免疫治療。
非特異性的免疫治療包括溶瘤病毒，非特性的過(guò)繼免疫細(xì)胞治療如TILs、NK、NKT，PD-1/PD-l1抗體，干擾素等 。
特異性免疫治療包括工程化基因修飾的CAR-T和TCR-T細(xì)胞治療，靶向GPC3/Epcam的單克隆抗體以及腫瘤疫苗等 。
接下來(lái)主要來(lái)回顧下工程化基因修飾的特異性細(xì)胞治療CAR-T和TCR-T，看看CAR-T和TCR-T為我們帶來(lái)了哪些改變？
【CAR-T和TCR-T的概念】
CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）是將能識(shí)別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-ζ鏈或FcεRIγ的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個(gè)嵌合蛋白，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)?；颊叩腡細(xì)胞被“重編碼”后，生成大量腫瘤特異性的CAR-T細(xì)胞。這是一個(gè)出現(xiàn)了很多年，但是近幾年才被改良使用到臨床上的新型細(xì)胞療法。和其它免疫療法類似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫細(xì)胞來(lái)清除癌細(xì)胞，但是不同的是，這是一種細(xì)胞療法，而不是一種藥。
TCR-T（T cell receptor ,TCR）技術(shù)是將能夠特異性與抗原結(jié)合的TCR基因轉(zhuǎn)入T淋巴細(xì)胞，使其獲得與表達(dá)該抗原腫瘤細(xì)胞結(jié)合并誘發(fā)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的新的免疫細(xì)胞治療模式。TCR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)目的抗原的靶細(xì)胞具有強(qiáng)大攻擊能力，但是受MHC限制，且在TCR-T制備過(guò)程中較容易針對(duì)新抗原。新抗原特異性TCR-T細(xì)胞治療是近年來(lái)抗腫瘤細(xì)胞免疫治療技術(shù)的一個(gè)十分有潛力的方向。
CAR-T與TCR-T模式圖
【肝細(xì)胞肝癌過(guò)繼細(xì)胞治療的靶點(diǎn)】
(1)AFP：甲胎蛋白(AFP)是在早期哺乳動(dòng)物胚胎血清中發(fā)現(xiàn)的一種70 KDa的糖蛋白，出生后，血清水平迅速下降，到第二年時(shí)，在血清中只能檢測(cè)到微量。高達(dá)50%的HCC腫瘤表達(dá)AFP。甲胎蛋白在非惡性肝臟中的表達(dá)可以發(fā)生，特別是在祖細(xì)胞亞群和慢性炎癥期間，表達(dá)水平通常低于肝癌。
(2)Glypcan-3(GPC-3)是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的成員，控制細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。GPC-3是一種抗原，在70%以上的肝癌組織中表達(dá)，但在非惡性組織中很少表達(dá)。最近的研究表明，腫瘤細(xì)胞中GPC-3的表達(dá)越高，肝癌的預(yù)后越差。
(3)黑色素瘤抗原基因家族(MAGE)由12個(gè)成員組成，幾乎只在多種惡性腫瘤的癌組織中表達(dá)。在肝細(xì)胞癌的RNA表達(dá)中，MAGE-1和MAGE-3的表達(dá)率約為68%。幾種MAGE肽已被證明能在黑色素瘤患者中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。
(4)紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1(NY-ESO-1)是由180個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。作為腫瘤睪丸抗原(CTA)家族的一員，NY-ESO-1在精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、卵原細(xì)胞和胎盤以及黑色素瘤、卵巢癌、宮頸癌、胃癌和肝癌等多種癌癥中均有表達(dá)。在Nakamura等人的研究中，41例肝細(xì)胞癌中有18例(43.9%)檢測(cè)到NY-ESO-1mRNA。
(5)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)通過(guò)調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度，在腫瘤細(xì)胞永生化中起關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道，80%-90%的肝細(xì)胞癌(HCC)表達(dá)hTERT。此外，含有hTERT表位的多肽能夠誘導(dǎo)hTERT特異性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞。
(6)NK組2成員D配體(NKG2DL)是一種Ⅱ型跨膜錨定的C型凝集素樣蛋白受體，表達(dá)于NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞亞群和某些自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞上。腫瘤基因組圖譜和肝癌樣本微陣列顯示NKG2DL在正常細(xì)胞表面普遍缺失，但在惡性腫瘤細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)，為CAR-T治療提供了良好的靶點(diǎn)。最近的體外研究報(bào)道了NKG2D CAR-T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株的有效殺傷作用。
(7)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)是一種由314個(gè)氨基酸組成的I型膜蛋白，其中只有26個(gè)氨基酸面向胞漿。EpCAM具有致癌潛力，并通過(guò)釋放其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域而激活，該結(jié)構(gòu)域可通過(guò)與WNT途徑的元件接觸而進(jìn)入細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)EpCAM在多種癌癥中經(jīng)常過(guò)度表達(dá)，包括肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
(8)粘蛋白1糖蛋白1(MUC1)屬于人類上皮粘蛋白家族，其在正常細(xì)胞上的表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)是隱藏的，其在腫瘤上的異常糖基化(大量O-糖基化串聯(lián)重復(fù)序列)創(chuàng)造了免疫系統(tǒng)識(shí)別的新表位]。體外和異種移植模型的臨床前研究證實(shí)了用于CAR-T治療的MUC1靶點(diǎn)。
(9)病毒抗原：病毒表面蛋白不受現(xiàn)有抗病毒藥物的控制，通常在整合了病毒基因組的肝細(xì)胞癌中維持。在體外和小鼠中，針對(duì)HBV表面蛋白的CAR-T細(xì)胞使人類T細(xì)胞能夠殺死HBV感染的人肝細(xì)胞并消除病毒DNA。
【肝細(xì)胞肝癌過(guò)繼免疫細(xì)胞治療的療效】
TCR-T
在2020年國(guó)際肝病大會(huì)(LBO12)上，Sangro等人展示了關(guān)于基因工程親和力增強(qiáng)的自體特異肽增強(qiáng)親和受體T細(xì)胞(AFPc332T細(xì)胞)的令人感興趣數(shù)據(jù)。在這項(xiàng)首次人肝癌研究中，患者必須是HLAA*02：01+或02：642+，免疫組織化學(xué)檢測(cè)≥1+在≥20%肝癌細(xì)胞或血清甲胎蛋白≥4 0 0 ng/mL中有甲胎蛋白表達(dá)，在非癌肝組織中有≤5%甲胎蛋白表達(dá)。4例患者接受了50億或更多的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞治療(3組3例，擴(kuò)張期1例)：1例完全應(yīng)答，1例病情穩(wěn)定，2例進(jìn)展期。隊(duì)列3中的第一個(gè)患者得到了確認(rèn)的部分應(yīng)答(CPR)，靶病灶減少了100%；一個(gè)非靶病變?cè)诘?周仍然存在。這與血清AFP水平從基線的6531 ng/mL迅速持續(xù)下降到第12周的14 ng/mL有關(guān)。
CAR-T
2020年8月，上海仁濟(jì)醫(yī)院的翟博教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表了GPC3-CAR-T細(xì)胞I期試驗(yàn)結(jié)果。在兩項(xiàng)前瞻性的I期研究(NCT02395250和NCT03146234)中，晚期GPC3+HCC(Child-Pugh A)的成人患者在環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)的淋巴枯竭后接受自體CAR-GPC3 T細(xì)胞治療。截至2019年7月24日的數(shù)據(jù)截止日期，共有13名患者接受了19.9×108個(gè)CAR-GPC3 T細(xì)胞的中位數(shù)。初步療效數(shù)據(jù)令人振奮，2例部分緩解，1例持續(xù)穩(wěn)定的患者在44.2個(gè)月后存活。3年、1年和6月的OS率分別為10.5%、42.0%和50.3%。然而，毒性是一個(gè)主要問(wèn)題，因?yàn)榧?xì)胞因子釋放綜合征(CRS)發(fā)生在9/13例患者中，其中包括1例G5 CRS。在這位患者中，輸入了20.0×108個(gè)細(xì)胞，第二天，患者經(jīng)歷了與CRS相關(guān)的嚴(yán)重低血壓、發(fā)熱、肺水腫和血漿IL-6升高(18000pg/mL)。重癥監(jiān)護(hù)病房轉(zhuǎn)院后，患者于第19天死于多器官功能衰竭。另外4名患者接受了大劑量類固醇治療，其中2名患者還接受了抗IL6受體的單抗tocilizumab治療CRS。
【存在的主要問(wèn)題及可能的解決方法】
工程化T細(xì)胞目前主要存在以下五大問(wèn)題：
（1）特殊的腫瘤微環(huán)境(TME)。首先，對(duì)于工程化修飾的TCR/CAR-T細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能面臨間質(zhì)血管限制或物理屏障，限制了T細(xì)胞接觸腫瘤細(xì)胞(運(yùn)輸和歸巢)的可能性。其次，在實(shí)體瘤中，T細(xì)胞必須面對(duì)由細(xì)胞因子(MDSC、M2巨噬細(xì)胞、Tregs、BRegs、DCRegs、CAF)和免疫抑制細(xì)胞因子(IL10、TGFb)組成的免疫抑制TME。
（2）抗原異質(zhì)性的問(wèn)題?？乖漠愘|(zhì)性降低了ACT在實(shí)體瘤中的療效。此外，在接受CAR-T細(xì)胞治療的實(shí)體腫瘤患者中經(jīng)常觀察到抗原丟失。克服腫瘤異質(zhì)性和抗原丟失的一個(gè)可能的解決方案是設(shè)計(jì)同時(shí)以多種抗原為靶點(diǎn)的T細(xì)胞。
（3）有限的擴(kuò)增和持續(xù)性。在已發(fā)表的GPC3-CAR-T細(xì)胞1期結(jié)果，所有患者外周血CAR-GPC3DNA拷貝數(shù)的中位數(shù)迅速增加，在中位時(shí)間10.5d(平均13.8d)后達(dá)到峰值360.4拷貝/mg基因組DNA(范圍28.0-23358.0拷貝/mg基因組DNA)，持續(xù)時(shí)間中位數(shù)19.5d(平均34.4d)，所有患者的外周血CAR-GPC3DNA拷貝數(shù)中位數(shù)在10.5d(平均13.8d)后達(dá)到峰值(28.0-23358.0拷貝/mg基因組DNA)，持續(xù)中位數(shù)為19.5d(平均34.4d)。
（4）脫靶效應(yīng)。由于靶抗原可以在非腫瘤組織中共享，嚴(yán)重非靶標(biāo)毒性的風(fēng)險(xiǎn)很高。關(guān)于細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)，在先前報(bào)道的針對(duì)GPC-3的CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)中，9/13例患者發(fā)生了CRS，其中包括1例G5 CRS(第19天中毒死亡)。在實(shí)體瘤中已經(jīng)描述了5級(jí)CRS，特別是當(dāng)靶向ERBB2時(shí)，T細(xì)胞識(shí)別肺上皮細(xì)胞中低水平的靶抗原。
（5）臨床適用性。在肝癌臨床中過(guò)繼細(xì)胞回輸?shù)囊粋€(gè)主要限制與早期臨床試驗(yàn)中選擇標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)量有關(guān)。首先，在TCR工程T細(xì)胞中，HLA限制會(huì)導(dǎo)致大量患者的喪失。其次，大多數(shù)試驗(yàn)要求肝功能Child Pugh A級(jí)。最后，如果加上強(qiáng)制性的PS評(píng)分，可能從這些治療中受益的患者的潛在頻率變得非常低。
從發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看，過(guò)繼免疫細(xì)胞治療正日益向我們走來(lái)。聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，局部經(jīng)肝動(dòng)脈給藥等方法的實(shí)話，將會(huì)極大的提高過(guò)繼免疫細(xì)胞治療的療效 。
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