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2023年2月，ClinGen序列變異解釋小組(Sequence Variant Interpretation, SVI)對剪接變異的致病性提出了相關(guān)建議(這篇文章是預(yù)印本，沒有經(jīng)過同行評議；意思就是這文章是尚未評估的新醫(yī)學(xué)研究，不應(yīng)用于指導(dǎo)臨床實(shí)踐)。

美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)和分子病理學(xué)協(xié)會(Association for Molecular Pathology, AMP)提出對剪接變異進(jìn)行致病性分類，可使用了六種致病性證據(jù)類別：PVS1(疾病機(jī)制為功能喪失的基因的無效變異)、PS3(功能試驗(yàn)顯示剪接變異有破壞作用)、PP3(預(yù)測工具支持剪接效應(yīng))、BS3(功能試驗(yàn)顯示剪接變異沒有破壞作用)、BP4(預(yù)測工具表明沒有剪接效應(yīng))、BP7(沉默變異即同義變異對剪接沒有影響)。

PVS1是指(假定的)功能喪失(Loss of fucntion, LoF)變異的預(yù)測性證據(jù)，包括無義變異、移碼突變、經(jīng)典剪接位點(diǎn)、單或多外顯子缺失/重復(fù)、起始密碼子等；適用于已知致病機(jī)制是LoF的大部分基因；但也可能存在人為主觀性選擇將LoF作為基因的致病機(jī)制的情況。

詳見??PVS1證據(jù)怎么用？來自ClinGen SVI的建議 (2018年版)

目前可以使用一些工具來評估LoF：①ClinGen的單倍劑量不足評分(haploinsufficiency score, HI)、②LoF不耐受評分(the probability of being  LoF intolerance score, pLI)、③LoF觀察/預(yù)期上限分?jǐn)?shù)(loss-of-function observed/expected upper bound fraction, LOEUF)。

LoF變異，也稱為失活變異，導(dǎo)致基因的產(chǎn)物數(shù)量減少或喪失功能(部分或全部失活)。

①ClinGen的HI和TS評分系統(tǒng)

單倍劑量不足(haploinsufficiency, HI)指一個(gè)等位基因突變后，另一個(gè)等位基因能正常表達(dá)，只有50%的正常蛋白質(zhì)水平，而這不足以維持細(xì)胞的正常生理功能。

三倍劑量敏感(triplosensitivity)是指基因拷貝數(shù)異常增加，過表達(dá)的蛋白或基因產(chǎn)物導(dǎo)致生理功能異常。

ClinGen成立的循證評價(jià)(evidence‐based review, EBR)工作組，建立一個(gè)分級系統(tǒng)，用來評估CNVs或基因與臨床的相關(guān)性，該分級系統(tǒng)根據(jù)以下內(nèi)容：已報(bào)道的致病突變數(shù)，遺傳方式，表型一致性，大規(guī)模case-control研究，致病機(jī)制，公共人群數(shù)據(jù)庫，專家共識，并定期整合新的證據(jù)，對基因/CNVs區(qū)域進(jìn)行重新評價(jià)。因此劑量敏感評級是動態(tài)的。ClinGen評估了Loss of fucntion和triplosensitivity，并給出相應(yīng)的分值，分值對應(yīng)著證據(jù)強(qiáng)度和解釋說明，如下表。

②pLI評分體系

pLI (the probability of intolerance to heterozygous pLoF variation)適用度很廣，是基于60,706人的全外顯子組數(shù)據(jù)庫(Exome Aggregation Consortium, ExAC)建立的模型。ExAC通過模型比較每個(gè)基因內(nèi)觀察到的罕見突變和期望的罕見突變數(shù)據(jù)，通過Z score量化這種偏離。

pLI分值是一種預(yù)測值，是一個(gè)給定基因歸類到Haploinsufficient類別中的概率，也就是對LoF不耐受的分值。pLI將有足夠長度的基因分為:pLI≥0.9，LoF突變不耐受基因，共3230個(gè)基因；pLI ≤0.1，LoF突變耐受基因，共10,374個(gè)基因。分值越高，越不耐受（intolerant），分值越低，越耐受（tolerant）。當(dāng)然，具體運(yùn)用中，不能僅根據(jù)pLI值就判定一個(gè)LoF變異的致病性，還要同時(shí)考慮如疾病發(fā)病年齡、外顯率、Haploinsufficiency score等。

③LOEUF評分體系

gnomAD的前身是ExAC，經(jīng)過多年的積累，數(shù)據(jù)量已經(jīng)提升到了15,708人的全基因組測序(WGS)和125,748人的全外顯子組測序(WES)，觀察到小的基因變異(單核苷酸變異SNVs、短的插入/缺失變異Indels)從7.4 million上升到了241 million。在篩掉了測序和注釋錯(cuò)誤引起的變異位點(diǎn)，gnomAD數(shù)據(jù)庫中確定了443,769個(gè)高可信度的預(yù)測的LoF變異。使用改進(jìn)的人類突變率模型，按照失活耐受性對人類蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行分類，并建立LOEUF模型。(Karczewski et al 2020)。比較“真實(shí)觀察到的變異數(shù)量值observation”和“通過某些方法建模得到的變異數(shù)量的期望值expectation”，用每個(gè)基因的O/E比值，來評估評估LoF不耐受。pLI和LOEUF預(yù)測都依賴于轉(zhuǎn)錄本的選擇，評估對生殖適度的不耐受程度。因此，在評估LoF變異是否在人群數(shù)據(jù)中觀察到時(shí)，必須考慮發(fā)病年齡和疾病嚴(yán)重程度。推薦LOEUF(在gnomAD v2.1版本可查)，其優(yōu)于pLI。LOEUF閾值為<0.35提示LoF不耐受，與pLI>0.9相當(dāng)。

如果某個(gè)基因的致病機(jī)制既可以是LoF，又可以是功能獲得性機(jī)制(gain-of-function, GoF)機(jī)制，該基因變異也符合PVS1證據(jù)，預(yù)測是會導(dǎo)致GoF(或功能實(shí)驗(yàn)觀察到的)，這種情況下，建議使用PM4證據(jù)(由于框內(nèi)缺失/插入和終止密碼子喪失導(dǎo)致的蛋白長度改變)，而不是PVS1。

經(jīng)典的真核生物±1,2 位剪接位點(diǎn)(Canonical ±1,2 splice variants)是指內(nèi)含子區(qū)域的變異，且靠近外顯子的第一和第二位置，這類變異通常被認(rèn)為(假定的)是具有LoF致病機(jī)制。U2剪接體識別的供體和受體的核苷酸分別是5'端(GT)和3'端(AG)(發(fā)生在＞98%的情況，高度保守的)。極少數(shù)情況下，U12型剪接體識別AT-AC內(nèi)含子。供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)基序的標(biāo)準(zhǔn)剪接區(qū)域分別由外顯子的最后3個(gè)核苷酸至鄰近該外顯子的內(nèi)含子序列的6個(gè)核苷酸，和，外顯子的第1個(gè)核苷酸至該外顯子邊界上游的20個(gè)核苷酸組成。

更多剪接變異內(nèi)容→mRNA異常剪接與遺傳病

PVS1證據(jù)適用于大多數(shù)真正的LoF變異，但仍需要評估基因結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)，如選擇性剪接變異、mRNA穩(wěn)定性、對蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能的影響。對于典型的剪接變異，需評估和預(yù)測剪接位點(diǎn)的發(fā)生機(jī)制，最終的PVS1證據(jù)強(qiáng)度取決于以下四種剪接變異的補(bǔ)救機(jī)制。

無義突變(nonsense mutation)是基因序列中編碼氨基酸的密碼子突變成終止密碼子(TAA, TAG, TGA)的單堿基突變。無義突變能產(chǎn)生提前終止密碼子(Premature termination codon, PTC)，導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生較小、不具功能的蛋白產(chǎn)物。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.org)的統(tǒng)計(jì)，在疾病相關(guān)的單堿基突變中，無義突變占超過20%。

無義突變會使全長的蛋白數(shù)量減少，因?yàn)橹挥?%~25%攜帶無義突變的轉(zhuǎn)錄本不會發(fā)生無義介導(dǎo)mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)。事實(shí)上，截短蛋白的形成并不經(jīng)常發(fā)生在體內(nèi)，包括人類和酵母等低等生物，許多生物都通過NMD途徑降解攜帶無義突變的mRNA，阻止其被翻譯成無功能多肽蛋白。

組成型外顯子(constitutive exon)：這些外顯子在該基因的所有不同版本的轉(zhuǎn)錄本中都出現(xiàn)，不被選擇性剪切。

以下四種情況需要謹(jǐn)慎考慮PVS1，因?yàn)榇祟怢oF變異可能不會造成明顯的基因功能異常和臨床效應(yīng)。①PTC出現(xiàn)在編碼序列3'末端仍可以表達(dá)長度縮短的有功能的蛋白質(zhì)；②無義變異、移碼變異位于非組成型外顯子上或缺失包含了非組成型外顯子；③框內(nèi)剪接或基因組缺失/重復(fù)導(dǎo)致較短或較長但仍有功能的蛋白質(zhì)；④通過使用框內(nèi)可替代的ATG來“挽救”起始密碼子變異。

Young et al (1998)首次被提出補(bǔ)救模型(rescue model)(作者稱之為減少單倍劑量不足)用于解釋與APC基因c.1192_1193del；p.Lys398Glufs*5相關(guān)的家族性腺瘤性息肉病。該無義變異位于APC基因第9號外顯子，該區(qū)域可發(fā)生生理性選擇性剪接。由此產(chǎn)生了生理性選擇性受體移位亞型r.934_1236del；p.Val312_Gln412del，也被注釋為Δ(E9p303)，可在正常結(jié)腸黏膜中高水平表達(dá)。

de la Hoya et al (2016)也提出了類似的補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄機(jī)制(rescue transcript mechanism)，以解釋BRCA1基因變異c.[594-2A>C;641A>G]引起第10號外顯子跳躍并不是高危變異。在這個(gè)例子里，補(bǔ)救機(jī)制歸因于將9號和10號外顯子剪切掉的生理性轉(zhuǎn)錄本。在大多數(shù)組織中(包括正常乳腺和卵巢上皮)，這種Δ(E9,10)亞型轉(zhuǎn)錄本占BRCA1基因總體表達(dá)轉(zhuǎn)錄本水平的20%~30%。

因此 識別能編碼有功能(或部分功能)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本(除參考轉(zhuǎn)錄本外)，和，確定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的生理表達(dá)水平是否與其作為補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本的潛力相匹配 是相當(dāng)重要的。

一個(gè)補(bǔ)救選擇性剪接的例子?？s寫:E, 外顯子(exon)；FL，全長(Full length)；TSS，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start site)；TTS，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(Transcription termination site)

stop gain 變異1 (翻譯提前終止) 位于2號組成型外顯子，是能引起功能喪失的變異(PVS1證據(jù))。相比之下，stop gain 變異2位于3號外顯子(非組成型外顯子)，該外顯子不出現(xiàn)在Δ(E3)補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本中(即3號外顯子發(fā)生跳躍，被選擇性剪切掉)，該變異也就不是真正的LoF變異。

因此該變異的LoF致病機(jī)制取決于3號外顯子跳躍后的轉(zhuǎn)錄本對蛋白的影響及其在總體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中的相對水平。如果Δ(E3)轉(zhuǎn)錄本編碼的是(部分)功能性蛋白，則該轉(zhuǎn)錄本可能是真的補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本，位于3號外顯子無義變異與風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)(或其風(fēng)險(xiǎn)小于在組成型2號外顯子上的無義變異)。

一個(gè)自然發(fā)生的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本挽救GT-AG剪接位點(diǎn)變異的例子

在這個(gè)例子中，該基因表達(dá)兩種自然發(fā)生的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本亞型：全長(FL)和Δ(E2,3)。3號外顯子處的受體位點(diǎn)的剪切變異經(jīng)預(yù)測(或能被檢測到)僅產(chǎn)生Δ(E3)和Δ(E2,3)轉(zhuǎn)錄本。如果Δ(E2,3)轉(zhuǎn)錄本能正常表達(dá)有功能的蛋白產(chǎn)物，那么IVS2-1G>T變異不屬于LoF變異。Δ(E2,3)將作為IVS2-1G>T變異的自然發(fā)生的補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本。此外，Δ(E2,3)補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本可能由任何針對2號和3號外顯子的GT-AG變異產(chǎn)生。

框內(nèi)剪接變異和候選補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本的識別

該圖強(qiáng)調(diào)評估框內(nèi)變異可能產(chǎn)生的功能影響及其作為補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本的潛力。

建議使用相同的基因特異性原理來注釋正常發(fā)生的框內(nèi)的選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本作為候選補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本。

在評估預(yù)測的功能影響時(shí)，必須首先考慮自然發(fā)生的框內(nèi)變異對基因總體表達(dá)的相對貢獻(xiàn)。如果由框內(nèi)變異造成轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量＜10%的基因總體表達(dá)量，那么該轉(zhuǎn)錄本不能成為候選補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本。

其次，框內(nèi)變異涉及到區(qū)域是否為關(guān)鍵功能域。如果框內(nèi)變異造成蛋白關(guān)鍵功能域丟失，那么該轉(zhuǎn)錄本也不能成為候選補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本。

如果新的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)發(fā)生在最靠近框內(nèi)ATG位置，無義變異發(fā)生在開放閱讀框的3'末端，那么還必須考慮所蛋白丟失的區(qū)域。如果框內(nèi)變異造成10%以上蛋白序列丟失，那么該轉(zhuǎn)錄本也不能成為候選補(bǔ)救轉(zhuǎn)錄本。

選擇性剪接導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)差異，可影響細(xì)胞功能并促進(jìn)疾病的發(fā)生。此外，異常剪接的結(jié)局通常因轉(zhuǎn)錄本水平和產(chǎn)生的蛋白質(zhì)閱讀框而異。PVS1證據(jù)準(zhǔn)確應(yīng)用的前提是非常清楚每個(gè)基因所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和功能。

為了促進(jìn)臨床參照的一致性，美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)和歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室-歐洲生物信息學(xué)研究所(European Molecular Biology Laboratories-European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)合作發(fā)布了參考轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫MANE (Matched Annotation from NCBI and EMBL-EBI- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/MANE/)。

解釋每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本的剪接效應(yīng)，需要了解蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵區(qū)域。識別蛋白質(zhì)功能域可使用基于同源的預(yù)測分析(如InterPro, Pfam數(shù)據(jù)庫)，功能性試驗(yàn)(如蛋白結(jié)構(gòu)域的缺失對蛋白功能影響的實(shí)驗(yàn))，和/或蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(如蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu))。既往對致病錯(cuò)義變異的研究也可以表明蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵區(qū)域。

新的建議有：

①變異引起框內(nèi)外顯子跳躍(蛋白功能關(guān)鍵區(qū)域)應(yīng)給予PVS1強(qiáng)度；

②根據(jù)關(guān)鍵區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)特征和框內(nèi)突變的大小/位置，給PVS1的權(quán)重降級；

③當(dāng)具有相同預(yù)測結(jié)果的(例如框內(nèi)外顯子跳躍)互補(bǔ)剪接位點(diǎn)變異(即同一外顯子的受體和供體位點(diǎn))被歸類為致病性時(shí)，PVS1的權(quán)重需要加強(qiáng)。

5'(或3')UTRs處的剪接變異應(yīng)注釋為PVS1_N/A，除非剪接變異預(yù)測會影響元件或/和蛋白質(zhì)功能和表達(dá)。【2018年更新的PVS1證據(jù)版本中，未提及5'(或3')UTRs處的剪接變異該如何評級】對應(yīng)下圖A的情況。

根據(jù)框內(nèi)可替代的起始密碼子的位置、它們相對于已知重要功能域的位置，致病變異位于正常的起始密碼子(ATG)3'端或位于框內(nèi)可替代的起始密碼子的5'端的情況，應(yīng)給予PVS1或PVS1_Strong證據(jù)【2018年更新的PVS1證據(jù)版本中，此情況評級為PVS1_Moderate】對應(yīng)下圖B的情況。

如果框內(nèi)缺失刪除了對蛋白功能至關(guān)重要的蛋白區(qū)域(例如在該蛋白結(jié)構(gòu)域中已鑒定出致病錯(cuò)義變異)，應(yīng)給予PVS1證據(jù)。【2018年更新的PVS1證據(jù)版本中，保留閱讀框的單個(gè)至多個(gè)外顯子缺失且截短的/改變的區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明該結(jié)構(gòu)域和/或該區(qū)域存在致病錯(cuò)義變異，此情況評級為PVS1_Strong】對應(yīng)下圖F的情況。

如果截短的區(qū)域?qū)?span>蛋白功能至關(guān)重要，應(yīng)給予PVS1證據(jù)，例如在該蛋白結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)剪接位點(diǎn)中已鑒定出致病錯(cuò)義變異。【2018年更新的PVS1證據(jù)版本中，如果10%以上蛋白質(zhì)序列丟失，不管該區(qū)域是否對蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要，此情況評級為PVS1_Strong】對應(yīng)下圖F的情況(原本table 1中應(yīng)該標(biāo)錯(cuò)了)。

PVS1證據(jù)怎么用？來自ClinGen SVI的建議 (2018年版)

有知道的同學(xué)，這個(gè)the rescue transcript應(yīng)該怎么翻譯比較好？