一、Real-time qPCR發(fā)展史
Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點，real-time qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)在已經(jīng)涉及到生命科學研究的各個領域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉基因研究等。
在Real-time qPCR技術的發(fā)展過程中，定量PCR儀的發(fā)展起了至關重要的作用。1995年，美國PE公司（已經(jīng)并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技術，1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，通過Ct值進行數(shù)據(jù)分析。從而熒光定量PCR獲得廣泛應用?，F(xiàn)在的定量PCR儀有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
隨國內生命科學的快速發(fā)展，科研水平不斷提高，發(fā)高水平文章已不再是新鮮事。與其同時，國內公司經(jīng)過長期不懈的努力，也有自主研發(fā)的real-time PCR儀器生產(chǎn)比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。
二、Real-time qPCR概述
1. Real-time qPCR原理
實時PCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。一般來講，定量PCR儀包括：實時熒光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機及應用軟件組成。其中基因擴增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴增儀大致相同，不同廠家不同型號的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機制冷、半導體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。
常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鎢燈和LED；熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機，光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴增過程中，熒光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。
2. Real-time qPCR的數(shù)學原理
首先來看一個real-time qPCR中的重要參數(shù)Ct值（Ct value），閾值（threshold），和基線（baseline）。一般來講，第3-15個循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節(jié)，位于指數(shù)期就可以。Ct值就是熒光值達到閾值時候的PCR循環(huán)次數(shù)。所以是一個沒有單位的參數(shù)。
那么為什么說Ct值跟初始模板的量成反比呢？我們來看PCR的擴增方程：
從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果從標準曲線上得到斜率（-3.3），就可以算出擴增效率（0.99）。一般來講PCR擴增效率在90%-110%都是可以用于數(shù)據(jù)分析的。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
3. Real-time qPCR的種類
根據(jù)real-time qPCR的化學發(fā)光原理可以分為2大類：一類為探針類，包括TaqMan@探針和分子信標，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBR@Green I或者特殊設計的引物(如LUX@Primers) 通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。
3.1 Taqman@探針法
Taqman@探針是最早用于定量的方法。就在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標記一個報告熒光基團，3’端標記一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，也就是FRET反應；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。
3.2 分子信標法
分子信標：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結構中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。
3.3 SYBR@Green 法
SYBR@Green I是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR@Green 熒光染料，SYBR@Green 熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR@Green 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
3.4 LUX@Primers法
LUX@ (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結構，使熒光淬滅。在有目標片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結構打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。
4. Real-time qPCR和常規(guī)PCR的區(qū)別
實時檢測（在對數(shù)擴增時期）而不是終點檢測
敏感性高
需要樣品少
特異性高
精確定量
三、Real-time qPCR實驗設計
實驗設計其實比實驗本身更重要！好的實驗設計可以事半功倍，節(jié)省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢盡可能完全的相關資料，整理好思路，設計好實驗路線。當然實驗過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對于一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和準備；然后引物設計，這步至關重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進行實驗和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨說明）。
1. 實驗材料的處理和準備
以最基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內要有生物重復，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。
一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材。現(xiàn)在新技術的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如***的RNAfixer 。
2. 引物設計
一般real-time PCR引物的設計遵循下面一些原則：
擴增產(chǎn)物長度在80-150bp。
引物應用核酸系列保守區(qū)內設計并具有特異性。
產(chǎn)物不能形成二級結構。
產(chǎn)物長度一般在15-30堿基之間。
G+C含量在40%-60%之間。
堿基要隨機分布。
引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
引物5’端可以修飾。
引物3’端不可修飾。
引物3’端要避開密碼子的第3位。
Taqman@探針的設計稍有不同，一般有公司設計合成。遵循下面以下原則：
盡量靠在上游引物；
長度30-45bp，Tm比引物高至少5℃；
5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量
四、Real-time qPCR操作過程
1. RNA提取和反轉錄
在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預防其污染是十分必要的。在實際的操作中應遵循下面一些原則：
1. 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。
2. 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。
當然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進行RNA的提取。
2.Mix配制
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統(tǒng)計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達豐度進行調整。當然這些都是經(jīng)驗值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進行優(yōu)化，達到一個最佳反應體系。在反應體系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反復凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標了?。┗蛘咂渌玖?，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為后面的定量做準備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。
G. 反應體系的設置：
A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。
需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。
設置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！
五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析
1. Real-time qPCR常見參數(shù)
基線（baseline）
通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：
為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
R2值：
另一個評估PCR效率的關鍵參數(shù)是相關系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關程度的統(tǒng)計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關的可信度很好。
精確度:
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標準偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250。
靈敏度：
無論CT絕對值是多少，任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數(shù)為1的系統(tǒng)都達到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應靈敏度的關鍵因素。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是，低拷貝時的模板數(shù)量不能按普通情況來預期。相反，它會遵循泊松分布，即進行大量的平行重復，平均應該含有一個拷貝的起始模板，實際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個拷貝，約18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重復實驗來提供統(tǒng)計顯著性，并克服泊松分布的限制。 評價熒光PCR結果的標準
因素 建議 指標
效率 5個數(shù)量級梯度稀釋 Slope～-3.3 R2>0.99
精密度 至少3個重復 標準差<0.25（0.5或者1個Ct之內）
靈敏度 增加低濃度樣本的重復數(shù) 統(tǒng)計分析
除了這些因素，還必須評估和驗證合適的實驗對照（如無模板對照，無 反轉錄酶對照等）以及模板質量。
3. Real-time qPCR定量方法
可以分絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒DNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是2-△△Ct。
3.1 絕對定量
3.2 2-△△Ct定量
3.3 其他定量方法
Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005
六、Real-Time qPCR常見問題分析
1.無Ct值出現(xiàn)
檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。
模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
2. Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）
擴增效率低: 反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR產(chǎn)物太長: 一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。
3. 標準曲線線性關系不佳
加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
標準品出現(xiàn)降解: 應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。
引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有信號
引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
6. 擴增效率低
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。
8. 擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
模板的濃度太高或者降
熒光染料的降解
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