原創(chuàng) 生物世界 生物世界 收錄于話題#新型基因編輯工具 11 個(gè) #CRISPR＆基因編輯 111 個(gè)
撰文 | 王聰
編輯 | 王多魚(yú)
排版 | 水成文
CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，通過(guò)向?qū)NA（gRNA）將Cas9酶靶向目標(biāo)DNA序列，Cas9酶切割目標(biāo)DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂，DNA在非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)時(shí)出錯(cuò)，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。
然而，CRISPR-Cas9存在較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，可能會(huì)在錯(cuò)位的基因位點(diǎn)切割DNA雙鏈，從而導(dǎo)致潛在風(fēng)險(xiǎn)，這也是限制CRISPR-Cas9基因編輯臨床應(yīng)用的一大因素。目前，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)始進(jìn)行多項(xiàng)基于CRISPR-Cas9基因編輯的臨床試驗(yàn)，降低其脫靶效應(yīng)是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
2022年3月2日，美國(guó)德州大學(xué)奧斯汀分校的研究團(tuán)隊(duì)在 Nature 期刊發(fā)表了題為：
Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9 的研究論文。
研究團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中脫靶背后的結(jié)構(gòu)機(jī)制，在此基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)了Cas9蛋白——SuperFi-Cas9，其脫靶概率降低了數(shù)千倍，且編輯效率與原始版本的Cas9蛋白相同。
CRISPR-Cas9基因編輯，通過(guò)向?qū)NA（gRNA）將Cas9酶靶向目標(biāo)DNA序列，Cas9酶切割目標(biāo)DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯，其中，向?qū)NA（gRNA）長(zhǎng)度為20bp，通過(guò)與目標(biāo)DNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)識(shí)別需要編輯的位點(diǎn)，然而，有時(shí)候在第18-20個(gè)堿基不匹配時(shí)，Cas9酶仍能進(jìn)行編輯，從而導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。
研究團(tuán)隊(duì)使冷凍電鏡來(lái)觀察Cas9與錯(cuò)配的DNA序列相互作用時(shí)候的結(jié)構(gòu)變化，從而解析錯(cuò)配時(shí)Cas9的激活機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向?qū)NA（gRNA）在第18-20個(gè)堿基錯(cuò)配時(shí)，這時(shí)的配對(duì)結(jié)構(gòu)較為松散，但Cas9酶并沒(méi)有放棄前進(jìn)，而是通過(guò)一個(gè)手指狀結(jié)構(gòu)緊緊抓住了錯(cuò)配區(qū)，從而穩(wěn)定了RNA-DNA雙鏈，使其表現(xiàn)的像是正確配對(duì)，為Cas9對(duì)DNA的切割鋪平道路。論文的第一作者 Jack Bravo 表示，這種情況就像一把椅子，其中一條腿斷了，用膠帶粘上，這時(shí)候它仍然可以作為椅子使用，但是有些搖擺不定。
俗話說(shuō)，眼見(jiàn)為實(shí)，該論文的通訊作者 David Taylor 表示：如果不是通過(guò)冷凍電鏡看到了Cas9在向?qū)NA（gRNA）錯(cuò)配時(shí)出現(xiàn)的這種手指狀結(jié)構(gòu)，自己在腦海里永遠(yuǎn)也想不到Cas9是通過(guò)這種機(jī)制增加了錯(cuò)配時(shí)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
基于這一開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)和見(jiàn)解，研究團(tuán)隊(duì)重新設(shè)計(jì)了Cas9酶，這一新版本的Cas9酶——SuperFi-Cas9，它的手指狀結(jié)構(gòu)部分被改造成遠(yuǎn)離DNA，從而在錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)用來(lái)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，因此Cas9酶就不再在錯(cuò)配位點(diǎn)切割和編輯DNA序列。
更重要的是，重新設(shè)計(jì)的SuperFi-Cas9，可以像天然Cas9酶一樣高效編輯DNA，但脫靶概率下降了約4000倍，因此安全性得到了大幅提升。
目前，已經(jīng)有其他實(shí)驗(yàn)室通過(guò)重新設(shè)計(jì)Cas9來(lái)降低其脫靶效應(yīng)，但所有這些Cas9版本都通過(guò)犧牲基因編輯效率來(lái)提高準(zhǔn)確性。
對(duì)于這種現(xiàn)狀，這篇 Nature 論文的第一作者 Jack Bravo 做了一個(gè)形象的比喻：不同實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的不同Cas9版本就像不同型號(hào)的自動(dòng)駕駛汽車(chē)，大多數(shù)都很安全，但它們的最高速度只有10英里/小時(shí)，雖然安全性提高了，但實(shí)用性也消失了。而SuperFi-Cas9則是一輛可以全速行駛且非常安全的自動(dòng)駕駛汽車(chē)，SuperFi-Cas9的脫靶概率比原始版本Cas9要降低4000倍，而且編輯效率一樣高。
目前，研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明了SuperFi-Cas9在試管中對(duì)DNA的編輯，在活細(xì)胞中測(cè)試的實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中，他們還在同步開(kāi)發(fā)更安全、更高效的Cas9新版本。
據(jù)悉，研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)對(duì)這項(xiàng)技術(shù)申請(qǐng)了專利，德州大學(xué)奧斯汀分校技術(shù)商業(yè)化辦公司也正在尋找?guī)椭@一技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用的合作伙伴。
CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，除了可能的脫靶效應(yīng)外，Cas9酶自身的大尺寸也是限制其更廣泛應(yīng)用的一大難題。近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室致力于開(kāi)發(fā)尺寸更小的Cas9酶，從而實(shí)現(xiàn)更好遞送。
例如，斯坦福大學(xué)亓磊團(tuán)隊(duì)于2021年9月在 Molecular Cell 期刊發(fā)表論文【2】，重新設(shè)計(jì)一款全新的迷你CRISPR系統(tǒng)——CasMINI，它就像“瑞士軍刀”一般，小巧玲瓏卻又功能眾多，更容易傳遞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，因此可以更好地應(yīng)用于CRISPR基因編輯的臨床治療。
詳情：
而CRISPR先驅(qū)、諾獎(jiǎng)得主 Jennifer Doudna 教授共同創(chuàng)立的基因編輯公司 Mammoth Biosciences 也在研究和開(kāi)發(fā)小型Cas酶，包括Cas14和Cas?。該公司于2021年9月獲得1.95億美元新融資，估值超過(guò)10億美元。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04470-1
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(21)00648-1
聯(lián)系客服
