“我是從哪里來的？”是每個人小時候都會問的問題?，F(xiàn)在我們都知道，每個人都是由一個小小的受精卵細胞經(jīng)過復(fù)雜的胚胎發(fā)育過程變來的。胚胎發(fā)育過程，就像一套完善的程序，從受精那一刻啟動，有條不紊、按部就班地逐漸運行程序的每一步，直到誕生一個鮮活的新生命(圖1)。
圖1. 每個人都是由一個小小的受精卵細胞經(jīng)過復(fù)雜的胚胎發(fā)育過程變來的
從一個受精卵，到一個由200多種不同類型細胞組成的人體，離不開細胞的增殖及細胞命運的分化。細胞命運的分化(differentiation)是指細胞發(fā)生一系列的內(nèi)外變化，產(chǎn)生在性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能上不同的細胞類型的過程。然而細胞在表現(xiàn)出明顯的形態(tài)和功能變化之前，會發(fā)生隱蔽性的變化，使細胞命運朝特定方向發(fā)展，這一過程稱為細胞命運決定(determination)或特化 (圖2)。
圖2. 干細胞的自我更新、特化及分化
19世紀80年代，胚胎學(xué)家Weismann提出了嵌合型發(fā)育(mosaic development)學(xué)說，他認為受精卵中存在大量的信息物質(zhì)——形態(tài)發(fā)生決定子(determinant，或稱為成型素、胞質(zhì)決定子)，隨著卵裂的進行，決定子會被不均等地分配到子細胞中去控制子細胞的發(fā)育命運。本質(zhì)上講，嵌合型發(fā)育學(xué)說認為組成有機體的所有細胞的命運，早在受精卵時期就已經(jīng)決定了。1887年胚胎學(xué)家Roux的實驗結(jié)果支持嵌合型發(fā)育學(xué)說。Roux用燒熱的解剖針破壞2-細胞期蛙胚的一個卵裂球，結(jié)果存活的另一個卵裂球只能發(fā)育為半個胚胎(圖3)。
圖3. Roux驗證嵌合型發(fā)育學(xué)說的實驗
1891年Hans Driesch以海膽為材料重復(fù)Roux的實驗，他將2-細胞時期的海膽胚胎分離成兩個單獨的卵裂球，結(jié)果得到了兩個發(fā)育正常但個體較小的海膽(圖4)。因此Hans Driesch提出了調(diào)整型發(fā)育(regulative development)學(xué)說，認為早期胚胎發(fā)育并不是一成不變的，允許胚胎細胞對命運做出適當(dāng)調(diào)整。
圖4. Driesch提出調(diào)整型發(fā)育的實驗
胚胎發(fā)育過程中第一次細胞命運決定發(fā)生在什么時期？是通過什么機制實現(xiàn)的？這是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域一直關(guān)注的問題之一。低等動物胚胎發(fā)育過程由于母源物質(zhì)豐富，合子基因激活較晚，其嵌合型發(fā)育模式在早期胚胎發(fā)育過程中得到了充分體現(xiàn)，例如，線蟲在第一次卵裂時形成一個AB大細胞和一個含有P顆粒的P1小細胞。第一次細胞命運分化在2-細胞時期發(fā)生，而第一次細胞命運決定則是由受精卵中P顆粒等母源物質(zhì)的分布不均實現(xiàn)的。哺乳動物的受精卵含有的母源物質(zhì)比低等動物要少得多，其合子基因激活在1-細胞末期即開始發(fā)生。從形態(tài)學(xué)角度，小鼠胚胎在8-細胞致密化之前各個卵裂球之間無明顯差別(圖5)。
圖5. 線蟲早期胚胎發(fā)育存在明顯的嵌合型發(fā)育模式但小鼠上并不是
以小鼠為例，人們對哺乳動物胚胎發(fā)育第一次細胞命運決定的認知，主要經(jīng)歷了三個階段。第一階段，早在1967年，基于形態(tài)學(xué)觀察內(nèi)外模型被提出，認為在囊胚腔出現(xiàn)后，胚胎細胞因環(huán)境不同有了明確的內(nèi)外分布，導(dǎo)致第一次命運決定[1]。第二階段，1981年，基于形態(tài)學(xué)觀察內(nèi)外極化模型被提出，認為在8-細胞時期發(fā)生的致密化，使胚胎外表面形成了致密的細胞膜，隨著細胞分裂的進行，致密化細胞膜在16-細胞時期出現(xiàn)不同程度的繼承，繼承了致密化細胞膜的細胞留在了胚胎表面，沒有繼承致密化細胞膜的細胞進入了胚胎內(nèi)部，導(dǎo)致第一次細胞命運分化[2,3]。第三階段，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，自2007年開始，越來越多的證據(jù)表明早在4-細胞期不同卵裂球之間就已經(jīng)出現(xiàn)差異，例如CARM1及PRDM14催化的組蛋白H3精氨酸甲基化水平，具有更高H3R26me2的卵裂球傾向ICM命運[4]；SOX2、OCT4與DNA結(jié)合程度及時間不同，結(jié)合更緊密的卵裂球傾向于ICM命運[5,6]；以及SOX2/OCT4靶基因表達水平高低，比如SOX21表達水平高的卵裂球傾向ICM命運[7]。即第一次細胞命運分化發(fā)生在4-細胞時期(圖6)。
圖6.對小鼠胚胎發(fā)育第一次細胞命運決定的認知發(fā)展
隨著高通量測序的發(fā)展，科學(xué)家們普遍認為小鼠2-細胞期兩個卵裂球之間已經(jīng)產(chǎn)生了差異，但究竟哪些差異會造成細胞命運分化？2-細胞期是否存在可以決定細胞命運的生物分子呢？
中國科學(xué)院動物研究所周琪實驗室和李偉實驗室一直從事細胞重編程及早期胚胎發(fā)育的研究，對重編程的機制、細胞全能性的本質(zhì)以及第一次細胞命運分化的機理充滿著深刻的好奇。近日，這兩個研究組在Cell上合作發(fā)表了一篇題為“Asymmetric expression of LincGET biases cell fate in 2-cell mouse embryos”的論文，對上述問題進行了闡釋。
在2016年，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華實驗室和中國科學(xué)院動物研究所周琪實驗室聯(lián)合報道了一個內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的小鼠2-細胞發(fā)育所必需的長非編碼RNA，其在小鼠2-和4-細胞期特異表達，干擾后胚胎阻滯于2-細胞晚期，作者將其命名為LincGET [8]。在這篇Cell文章中，作者對LincGET進行了進一步的研究。他們發(fā)現(xiàn)，LincGET在小鼠2-和4-細胞期各個卵裂球之間是不均等分布的(圖7)。那么這是否意味著LincGET將小鼠胚胎發(fā)育的第一次命運分化提前到了2-細胞階段呢？
圖7. LincGET在小鼠2-和4-細胞期各個卵裂球之間不均等分布
通過顯微注射的方法，在2細胞的一個卵裂球中過表達LincGET，同時注射核膜定位的綠色熒光蛋白GFP作為示蹤分子，然后在囊胚期對其子細胞命運進行分析。結(jié)果表明，過表達LincGET能使卵裂球傾向ICM命運。而過表達其他一些對照RNA并沒有這種影響命運分化的現(xiàn)象。另外，在過表達LincGET的同時干擾CARM1，卵裂球命運傾向于TE，表明LincGET調(diào)控ICM命運傾向依賴CARM1 (圖8)。
圖8. 過表達LincGET能使卵裂球傾向ICM命運
借助一系列的分子生物學(xué)手段，文章發(fā)現(xiàn)LincGET與CARM1形成復(fù)合體，并促進后者的核定位(圖9)。其中CARM1的反式轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域是與LincGET結(jié)合所必需的。
圖9. LincGET與CARM1形成復(fù)合體并促進后者的核定位
在功能方面，LincGET/CARM1復(fù)合體可以增加H3R26me修飾水平，提高Nanog、Sox2、Sox21等ICM特異基因的表達。通過ATAC-seq，文章發(fā)現(xiàn)LincGET/CARM1可以特異性提高ICM基因啟動子區(qū)域的開放程度(圖10)。
圖10. LincGET/CARM1可以特異性提高ICM基因的表達
為什么LincGET/CARM1會促進ICM命運呢？機制研究表明，LincGET/CARM1復(fù)合體能特異性結(jié)合轉(zhuǎn)座序列，建立激活型染色質(zhì)修飾H3R26me2等，增加轉(zhuǎn)座序列區(qū)域染色質(zhì)區(qū)域開放程度，并向周圍擴展，從而增加離轉(zhuǎn)座序列更近的多能性相關(guān)基因的染色質(zhì)區(qū)域開放程度，提高多能性相關(guān)基因的表達水平，從而促進ICM命運傾向(圖11)。
圖11. LincGET調(diào)控命運傾向的機制模型
文章首次將小鼠早期胚胎發(fā)育的第一次細胞命運決定推到了2-細胞時期，而且發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵分子是一個內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的長非編碼RNA。長非編碼RNA為分子生物學(xué)研究提供了新的層面，在多能性、神經(jīng)分化、癌癥發(fā)生等領(lǐng)域大顯身手，但由于實驗材料及實驗技術(shù)的限制，在早期胚胎發(fā)育過程中的功能研究屈指可數(shù)。該文章擴展了長非編碼RNA的功能領(lǐng)域，為早期胚胎中長非編碼RNA的功能探索，提供了新的參考和思路。
內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒在不同物種的早期胚胎發(fā)育過程中異常活躍，但人們對其功能知之甚少，目前仍停留在內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒活性與多能性水平相關(guān)的層面上：MuERV-L與2-細胞樣小鼠ESCs [9]；HERVK和naive-like的人ESCs [10]。該文章發(fā)現(xiàn)LincGET可以廣泛促進轉(zhuǎn)座序列的染色質(zhì)開放，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座序列傾向于靠近ICM相關(guān)基因，遠離TE相關(guān)基因，這就提出來一種可能——轉(zhuǎn)座序列的活化將染色質(zhì)活化信號向周圍擴展，從而激活I(lǐng)CM相關(guān)基因。這不僅擴展了內(nèi)源重復(fù)序列的功能機制，同時為早期胚胎發(fā)育過程中高度活躍的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究提供了新的線索和方案。
隨著基因編輯技術(shù)和干細胞技術(shù)的不斷革新，干細胞治療終將會帶來再生醫(yī)學(xué)的革新，如何獲得多能性等級更高甚至全能性的干細胞是干細胞領(lǐng)域關(guān)注的核心問題之一。早期胚胎無疑是最高全能性的代表，對全能性以及第一次細胞命運分化機理的探索，將會加深人們對早期胚胎全能性本質(zhì)的認識，為更高多能性甚至全能性干細胞的建立提供新的理論參考，驅(qū)動干細胞相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，推動干細胞治療走向臨床。
參考文獻
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8. Wang, J., et al., A novel long intergenic noncoding RNA indispensable for the cleavage of mouse two-cell embryos.EMBO Rep, 2016. 17(10): p. 1452-1470.
9. Macfarlan, T.S., et al., Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity, in Nature. 2012. p. 57-63.
10. Grow, E.J., et al., Intrinsic retroviral reactivation in human preimplantation embryos and pluripotent cells.Nature, 2015.
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