現(xiàn)如今，基于細(xì)胞的免疫療法已經(jīng)在臨床上取得了重大進(jìn)展，并進(jìn)入了推向市場的階段。包括CAR-T、工程化造血干細(xì)胞移植和其他有前景的細(xì)胞療法在內(nèi)，大量的臨床數(shù)據(jù)集都在增加。因此，為了滿足臨床和最終商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞的需求，強(qiáng)調(diào)生物制造是相當(dāng)必要的。
而強(qiáng)大的基礎(chǔ)設(shè)施應(yīng)該能夠解決目前在細(xì)胞收集、擴(kuò)增、操作、純化、保存和配制方面的局限性，最終向患者提供可接受的成本治療方案。在今天的這篇綜述中，我們重點介紹了前沿生物工藝技術(shù)的案例，這些技術(shù)能夠提高即將進(jìn)入臨床應(yīng)用的細(xì)胞療法的生物制造效率。
1. 目標(biāo)藥品的質(zhì)量概況QTPP
2. 大規(guī)模制造的貼壁細(xì)胞擴(kuò)增
3. 高通量細(xì)胞分選
4. CAR-T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的生產(chǎn)
5. 降低細(xì)胞生產(chǎn)制造成本
6. 細(xì)胞儲存和供應(yīng)鏈管理
在上一篇文章中，我們已經(jīng)詳細(xì)討論了前三部分，今天主要闡述的包括CAR-T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的生產(chǎn)、降低細(xì)胞生產(chǎn)制造成本以及細(xì)胞儲存和供應(yīng)鏈管理。
CAR-T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的生產(chǎn)
細(xì)胞工程通過遺傳操作對細(xì)胞進(jìn)行改造(圖4a)，使研究疾病機(jī)制、識別新藥物、操縱細(xì)胞功能以獲得生物制劑和基于細(xì)胞的療法成為可能。而將基因變化引入細(xì)胞的方法有很多，它們通常被歸類為病毒或非病毒。
后一類一般是通過化學(xué)基礎(chǔ)產(chǎn)品(例如脂質(zhì)體)或通過非化學(xué)方法(例如電穿孔)將核酸引入細(xì)胞的轉(zhuǎn)染技術(shù)，其中電穿孔技術(shù)已被用于引入RNA以瞬時修飾細(xì)胞功能，完全期望僅發(fā)生新遺傳物質(zhì)的短暫表達(dá)。為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)，在宿主細(xì)胞中引入編碼轉(zhuǎn)座子元件和轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒組合的轉(zhuǎn)染方式已經(jīng)被使用(例如Sleeping Beauty和piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng))；該方法相對具有成本效益，并且已經(jīng)用于CAR-T細(xì)胞治療白血病的早期臨床開發(fā)中。
然而，最常見的是，原代細(xì)胞和干細(xì)胞需要病毒轉(zhuǎn)染的方法，而不是電穿孔，以有效和穩(wěn)定地遞送遺傳物質(zhì)。然而值得注意的是，基于體外病毒基因治療的方法經(jīng)常被納入生物處理工作流，用于生產(chǎn)細(xì)胞療法。
圖4：采用不同基因修飾方法的細(xì)胞療法(圖片來源 nature)
細(xì)胞工程的一個突出例子是使用T細(xì)胞免疫療法靶向腫瘤相關(guān)抗原。其中，表達(dá)CD19受體的CAR-T細(xì)胞，已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病青少年患者以及難治性大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者。
首先，從患者的外周血中收集靜息的多克隆T細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)和純化之前用CD3或CD28磁珠活化以誘導(dǎo)擴(kuò)增。作為人工免疫受體，CAR賦予細(xì)胞特異性，活化和共刺激分子。
另外的轉(zhuǎn)基因可以包括在載體中，包括細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)蛋白、表面膜標(biāo)簽和自殺基因。雖然有CAR瞬時表達(dá)的例子，但患者的長期療效仍有待證實。相反，穩(wěn)定的嵌合受體表達(dá)和這些細(xì)胞的持久性是目前的標(biāo)準(zhǔn)，并且可能是有效性所必需的；因此，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將CAR穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞。通過改進(jìn)載體設(shè)計、制造以及使用諸如retronectin的附加試劑來幫助產(chǎn)生陽離子電荷以促進(jìn)病毒轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中(盡管這個過程很昂貴)，顯著提高CAR構(gòu)建體的效率。
而且載體制造過程難以標(biāo)準(zhǔn)化。其高度可變、依賴專業(yè)知識，需要靈活的制造過程，而且成本很高。雖然可以使用少量載體從而降低成本，但是這需要延長新工程化細(xì)胞的培養(yǎng)步驟，以獲得治療劑量的工程化T細(xì)胞。
目前，細(xì)胞工程也已成功應(yīng)用于各種單基因疾病的基因治療，包括重癥綜合性免疫缺陷、Wiskott-Aldrich綜合征、慢性肉芽腫病、腦腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和血紅蛋白病。在這種情況下，CD34+ 自體造血干細(xì)胞(HSC)是從任一骨髓或外周血中分離，用造血生長因子的混合物刺激，在啟動子的控制下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體攜帶有缺陷基因的正常拷貝進(jìn)行轉(zhuǎn)染。最后，經(jīng)過基因修飾的HSCs通過靜脈注射后移入骨髓，在骨髓中植入并產(chǎn)生表達(dá)正常蛋白的分化細(xì)胞。
在患者的預(yù)期生命期限內(nèi)，需要將載體整合到長期存在的HSC中以產(chǎn)生正常分化的細(xì)胞。在大多數(shù)情況下，需要進(jìn)行預(yù)處理以消除患者的至少一部分異常HSC并促進(jìn)遺傳修飾細(xì)胞的植入和持久性。在γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體引起的插入誘變導(dǎo)致患者病情進(jìn)展后，研究人員便開始探索能夠替代的載體，包括慢病毒和腺病毒，以及載體設(shè)計和自我失活載體使用的改進(jìn)；最近的研究沒有觀察到載體優(yōu)先整合到潛在的致癌區(qū)域，但未來，基因編輯方法可能取代基因轉(zhuǎn)染；除了避免潛在的插入誘變事件外，通過基因編輯對內(nèi)源性突變序列進(jìn)行修正，應(yīng)能夠在生理條件下控制基因表達(dá)的內(nèi)源性啟動子的控制下產(chǎn)生正常的基因產(chǎn)物。這可能會增強(qiáng)工程化細(xì)胞的效力，并使移植后的HSCs功能正常化。
預(yù)期提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的效率會對可擴(kuò)展性和成本產(chǎn)生很大影響，其中電穿孔是最常用的方法，而且現(xiàn)代的電穿孔技術(shù)能夠在保持高效率轉(zhuǎn)染的同時還能顯著減少細(xì)胞損傷。盡管細(xì)胞恢復(fù)和可擴(kuò)展性差，但這種經(jīng)過驗證的技術(shù)仍適用于臨床應(yīng)用。
MaxCyte(圖4b)、Nucleofector(Lonza)和Gene Pulsar(Biorad)等技術(shù)有效地提高了轉(zhuǎn)染規(guī)模。Lonza的Nucleofector產(chǎn)品組合可以有效轉(zhuǎn)染難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和具有不同底物的原代細(xì)胞，包括DNA載體和短發(fā)夾狀RNA、microRNA和短干擾RNA寡核苷酸。
該系統(tǒng)的通用型允許轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞，并且對細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)具有靈活性，添加96-well模塊或獨立反應(yīng)系統(tǒng)(如高通量核轉(zhuǎn)染系統(tǒng))的能力可以實現(xiàn)高通量轉(zhuǎn)染，在不到5分鐘內(nèi)對至少2×104個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染或利用4D-Nucleofector LV裝置轉(zhuǎn)染多達(dá)1×109個細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞類型，外周血單核細(xì)胞可達(dá)到約70％的效率，未刺激的人T細(xì)胞可達(dá)到90％。
MaxCyte為大多數(shù)常用細(xì)胞類型提供> 90％的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性和> 90％的轉(zhuǎn)染效率，允許在幾秒鐘內(nèi)在0.5×10^6和0.7×10^8個細(xì)胞之間的可擴(kuò)展性，在不到30分鐘內(nèi)可達(dá)到2×10^10個細(xì)胞。但用于轉(zhuǎn)染的電穿孔緩沖液和工作流程仍然存在問題，因為無葡萄糖和無蛋白質(zhì)的緩沖液可導(dǎo)致細(xì)胞的惡化。雖然如此，一些臨床試驗已經(jīng)使用電穿孔方法用于CAR-T細(xì)胞的制造，以及基因編輯策略，例如CRISPR/Cas9)進(jìn)一步修飾或改進(jìn)工程化T細(xì)胞產(chǎn)品。
吞吐量并行處理是實現(xiàn)自動化解決方案和分散式制造的重要步驟。例如，制造CAR-T細(xì)胞的半自動閉合系統(tǒng)Miltenyi Prodigy：包括T細(xì)胞刺激、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增的整個過程，在一臺儀器中進(jìn)行，能夠在不到30分鐘的時間內(nèi)電穿孔至多50ml的細(xì)胞懸浮液。
SQZ生物技術(shù)公司正在開發(fā)一種微流體通道，這種通道可以擠壓細(xì)胞(CellSqueeze)，在細(xì)胞膜上形成小氣孔，通過這些小孔，可以在保持細(xì)胞存活能力和功能的同時輸送物質(zhì)(圖4c)，并且能夠每秒處理100萬個細(xì)胞。
ThermoFisher Scientific的Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可確保在許多細(xì)胞類型中效率高達(dá)90％，每次反應(yīng)能夠從2×10^4轉(zhuǎn)染至6×10^6個細(xì)胞。具體而言，通過使用該技術(shù)，可以以23％的效率和95％的存活率轉(zhuǎn)染外周血單核細(xì)胞。該設(shè)計的主要優(yōu)點是更好地維持生理條件，與常規(guī)電穿孔相比，其能夠獲得更高的細(xì)胞存活率；然而，它配備了鍍金電極的高運行成本，具有專有的轉(zhuǎn)染緩沖液，以及Neon移液器吸頭和管的成本。
Avectas開發(fā)了一種專有的輸送解決方案，它最初使細(xì)胞膜透化，允許輸送材料擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，然后逆轉(zhuǎn)透化(圖4d)，有效控制負(fù)荷。Avectas的遞送效率為~53％，細(xì)胞存活率為78％(相比之下，電穿孔的效率和細(xì)胞存活率分別為93％和73％)。對于大多數(shù)方法，有效遞送必須與維持細(xì)胞活性平衡，以提供可擴(kuò)展的解決方案(Avectas還開發(fā)用于GMP制造的封閉連續(xù)系統(tǒng))。
有效細(xì)胞工程的另一個途徑源于納米粒子的研究；事實上，已經(jīng)有研究表明可生物降解的聚合物納米顆粒可以轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞。雖然每種方法通常依賴于細(xì)胞類型和目的，但生理學(xué)相關(guān)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效用仍然是一個挑戰(zhàn)，關(guān)鍵的瓶頸是實現(xiàn)可重復(fù)的有效轉(zhuǎn)染，低細(xì)胞毒性以及高通量輸出。
降低細(xì)胞生產(chǎn)制造成本
2007年，通過使用轉(zhuǎn)錄因子的組合將人成纖維細(xì)胞遺傳重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)。iPSC在生長特征和要求，多能性和重編程成各種成體體細(xì)胞的能力方面類似于胚胎干細(xì)胞(ESC)。并且考慮到倫理這一方面，更易于推進(jìn)。
然而，一方面，來自胚胎的每一個ESC細(xì)胞系都有主要組織相容性復(fù)合體和其他抗原的獨特表現(xiàn)；因此，從再生醫(yī)學(xué)和移植的角度來看，使用從第三方胚胎干細(xì)胞分化的體細(xì)胞會提高細(xì)胞受體排斥的機(jī)會。另一方面，因為GMP級別的iPSCs可以源自自體體細(xì)胞，所以可以減輕來自iPSC的分化細(xì)胞引起的排斥問題(圖5a)。已經(jīng)提出建立ESC細(xì)胞庫(haplobanks)，代表在不同群體中觀察到的主要組織相容性抗原。
這可以解決大量人群的移植排斥問題，并且可以解釋胚胎干細(xì)胞(ESCs)是否能立即分化成各種組織類型。此外，分化的iPSC也可能在藥物篩選中非常有用；例如，iPSC衍生的分化細(xì)胞系的集合可以基于種族和性別組裝成子集，這是影響藥物開發(fā)的幾個因素中的兩個。對于遺傳變異主要決定疾病發(fā)生和發(fā)展的疾病，而不是基于可能不精確的臨床診斷對樣本進(jìn)行分組，也可以對不同的基因型iPSCs進(jìn)行分組。這種方法可能對神經(jīng)和神經(jīng)精神疾病特別有用，因為新鮮的腦組織通常是不可獲得的，而且這些疾病通常是由多種不同的遺傳原因引起的。
圖5： 用于將PSCs區(qū)分為視網(wǎng)膜和神經(jīng)細(xì)胞譜系的當(dāng)前工具概述(圖片來源 nature)
這些應(yīng)用都說明了iPSCs的潛力。然而，通過衍生自完全分化的細(xì)胞來生產(chǎn)CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)的銷售成本是巨大的。為iPSC生成細(xì)胞庫是一項手動且勞動密集型的任務(wù)，需要大量的人力資本成本。每個重編程和臨床有用的iPSC群體可能需要數(shù)月才能從原代細(xì)胞集合中發(fā)展。推薦大約200-300個小瓶，每個小瓶約2×10^6個細(xì)胞，以具有足夠數(shù)量的iPSC以擴(kuò)增起始材料并產(chǎn)生最終產(chǎn)物。
一些公開報告指出，生產(chǎn)和驗證每個細(xì)胞系的成本約為10000-20000美元，滿足當(dāng)前GMP要求的額外成本介于每個細(xì)胞系50000美元至100000美元之間。產(chǎn)生適合臨床使用的iPSC衍生組織產(chǎn)品的產(chǎn)品開發(fā)成本甚至更高(約800000美元)。而且這些數(shù)字都排除了iPSC制造人員、設(shè)施和專用設(shè)備的大量啟動成本。雖然用于自體療法的iPSC似乎是一種替代方法，但是相同的限制范圍和個體化篩查問題使得基于自體iPSC的治療變得困難。
衍生自iPSC的細(xì)胞制造中的商品成本與所需的細(xì)胞處理和純化的量密切相關(guān)，從iPSC自身的衍生和維持開始。與CAR-T細(xì)胞的制造相反，iPSC的產(chǎn)生僅需要重編程基因的瞬時表達(dá)。通過仙臺病毒載體(細(xì)胞質(zhì)RNA病毒載體)、非整合型附著體載體、信使RNA轉(zhuǎn)染和其他方法引入重編程因子，從多種成體細(xì)胞類型中衍生而來，不需要載體整合到宿主基因組DNA中，避免了插入突變的威脅。然而，除了將成體細(xì)胞設(shè)計成iPSC所需的培養(yǎng)基條件之外，與產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因相關(guān)的成本還是很高的。
基于GMP和xeno-free試劑(如mTeSR1培養(yǎng)基，StemCell Tech)創(chuàng)建定義的培養(yǎng)基(圖5b，c)，最大限度地減少了手工菌落采摘和繼代培養(yǎng)所需的勞動力，盡管培養(yǎng)基需要生長因子，但這可以重新平衡這些增加的成本。另外，雖然iPSC可以在確定的培養(yǎng)基中生長，但是對生長基質(zhì)(例如Matrigel)的需求使得大規(guī)模培養(yǎng)成為挑戰(zhàn)。
細(xì)胞聚集體或微載體中的三維培養(yǎng)，例如通過使用旋轉(zhuǎn)錐形瓶、波動反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器或攪拌釜反應(yīng)器，這是干細(xì)胞培養(yǎng)方法的合理進(jìn)化。盡管這些系統(tǒng)允許細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增，但它們也提供了新的培養(yǎng)變量。
來自iPSC或ESC的分化過程也需要優(yōu)化以使用定義的細(xì)胞譜系作為CTPs(細(xì)胞治療產(chǎn)品)。來自發(fā)育生物學(xué)的知識現(xiàn)在可以通過特定的，定義的生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為實踐，這些培養(yǎng)基概括了譜系特異性分化過程(圖5d)。用于產(chǎn)生分化的細(xì)胞衍生物的方案處于初期階段，需要過多的時間和勞力，并且通常會產(chǎn)生相對不成熟的細(xì)胞。目前的策略通常涉及為多能干細(xì)胞(PSC)的起始群體提供特定譜系的必要因子。這可以通過重建PSC的3D生態(tài)位的特性來間接實現(xiàn)，或者通過將所需的細(xì)胞因子和生長因子直接喂養(yǎng)到培養(yǎng)的PSC中來實現(xiàn)。
但這兩種分化方法都需要長而昂貴的培養(yǎng)方案，需要大量細(xì)胞因子和生長因子以及長培養(yǎng)時間(50-100天)，并且在細(xì)胞成為CTP之前需要頻繁的人工處理。而且，除了未分化的PSC的直接致瘤風(fēng)險之外，iPSC和ESC細(xì)胞系的連續(xù)培養(yǎng)可能引入總?cè)旧w改變和特定基因中的小突變的累積，以及對iPSC的衍生、表征、分化和純化不容易自動化。
設(shè)計用于指導(dǎo)PSC分化的小分子可以提供超過生物制劑的顯著成本優(yōu)勢，并使PSC制造和擴(kuò)大規(guī)模的經(jīng)濟(jì)性更具吸引力。然而，合適的小分子的設(shè)計需要了解管理譜系定型的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖5e)。解決這些問題以產(chǎn)生候選目標(biāo)的一種方法是使用大規(guī)?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。
事實上，在使用小分子將PSC定向分化成定型細(xì)胞譜系方面已經(jīng)取得了一些成功。此外，由CRISPR和轉(zhuǎn)錄激活器的效應(yīng)核酶所激活的基因操作的日益簡化，開啟了一種可能性，即用一種內(nèi)在的事件序列取代定向分化的外在控制。
例如，引入可調(diào)的基因片段來調(diào)節(jié)發(fā)育路徑，減少了對外源性因素及其相關(guān)產(chǎn)品成本的持續(xù)供應(yīng)的需要?？梢缘统杀局圃斓恼{(diào)節(jié)RNAs的利用(圖5f)是通過降低成本實現(xiàn)可行的CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)擴(kuò)大的另一個令人興奮的途徑。微小RNA顯示出實現(xiàn)定向分化的希望，并且大基因間非編碼RNA與多能性的誘導(dǎo)密切相關(guān)。基因傳遞技術(shù)的效率肯定會加速這些方法在標(biāo)準(zhǔn)實踐中的引入。
下一代合成生物學(xué)和基因編輯工具也可以用于創(chuàng)建新的生物加工工具。改進(jìn)的方法和試劑應(yīng)該促進(jìn)可重復(fù)的方案的創(chuàng)建，以持續(xù)地誘導(dǎo)人類分化細(xì)胞類型。
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細(xì)胞儲存和供應(yīng)鏈管理
盡管在醫(yī)院或?qū)W術(shù)環(huán)境中進(jìn)行的許多早期試驗的細(xì)胞治療產(chǎn)品的保質(zhì)期受到的關(guān)注有限，但生物保存將在后期臨床試驗中發(fā)揮作用，并最終在商業(yè)化中發(fā)揮作用。設(shè)計質(zhì)量原則和保存解決方案允許產(chǎn)品滿足關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如效力，必須在后期試驗中應(yīng)用，因為起始和最終產(chǎn)品材料必須在臨床場所和生產(chǎn)設(shè)施之間運輸。通過最大化制造計劃和患者治療的可能性，延長產(chǎn)品保質(zhì)期的生物保存解決方案也將促進(jìn)物流的發(fā)展。
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冷凍保存：在極低溫度下儲存細(xì)胞(液氮為-196°C，蒸汽氮為-156°C；優(yōu)選以蒸汽儲存，以避免液相污染)，大大減少代謝活動，從而保持細(xì)胞健康。然而，必須最小化細(xì)胞內(nèi)冰的形成以防止細(xì)胞破裂。最常見的冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)已經(jīng)以1 g kg-1 day-1的劑量注射給患者，并且已被證明是安全的。
盡管DMSO使冰的形成最小化，但它對細(xì)胞也有毒性。因此，必須采取措施使接觸時間和滲透壓休克最小化。替代的冷凍保護(hù)劑，包括糖，例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、蔗糖和甘油，但其在維持生存力方面不如DMSO有效。然而，來自蠶的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物絲膠蛋白作為血清成分的替代品，在促進(jìn)封裝細(xì)胞存活和低溫貯藏方面顯示出有希望的結(jié)果。
在將DMSO加入到產(chǎn)品中后，應(yīng)以受控方式冷凍，以防止不合適的溫度梯度使細(xì)胞活性損失。通常，在控制速率的冷凍機(jī)中使用1-2℃ min-1的速率，盡管可以進(jìn)行重要的開發(fā)工作以優(yōu)化特定產(chǎn)品或容器的冷凍曲線。一旦CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)冷凍，它通常儲存在液氮中，如果需要，產(chǎn)品可以干燥運輸，一般情況下，能夠?qū)⒁旱牡蜏乇３謳滋欤疃鄡芍堋?/span>
雖然冷凍保存已經(jīng)使用了多年，但仍然存在穩(wěn)定后細(xì)胞功能的挑戰(zhàn)。最長期的例子是CD34 +細(xì)胞的低溫保存，其開始于胎兒臍帶血庫，其中細(xì)胞長期存儲(數(shù)十年)以用于將來治療中的潛在用途。雖然CD34 +細(xì)胞已經(jīng)冷凍保存多年，但許多因素的影響仍有待理解，例如冷凍保存前細(xì)胞在DMSO中的時間，以及DMSO加入細(xì)胞的具體方式。
此外，許多早期的研究可能是使用含有DMSO的低溫介質(zhì)進(jìn)行的，通常在每個實驗室中進(jìn)行不同的處理，這增加了可變性并且不能很好地控制。非標(biāo)準(zhǔn)化的低溫介質(zhì)可能含有不可持續(xù)的添加劑，如血漿或血清。
經(jīng)常用于細(xì)胞療法的含有DMSO的冷凍保護(hù)劑是CryoStor(BioLife Solutions)。值得注意的是，在這個相對較小的行業(yè)中，任何單一來源的試劑供應(yīng)商都可能被視為供應(yīng)鏈風(fēng)險。由于基因修飾的CD34+細(xì)胞目前正處于各種血液學(xué)應(yīng)用(如鐮狀細(xì)胞病和β地中海貧血)的臨床試驗中，工程細(xì)胞的脆弱性必須與冷凍保存相關(guān)，以確保有效的產(chǎn)品供應(yīng)。
然后，解凍過程需要盡可能地減少滲透壓沖擊。但是，它通常是手動執(zhí)行的，因此難以控制和標(biāo)準(zhǔn)化。解凍后，細(xì)胞很脆弱，必須盡快給藥以避免活力喪失。在冷凍傷是一個問題的情況下，如MSCs所建議的，細(xì)胞在給藥前被解凍和再培養(yǎng)以改善解凍后功能。然而，在理想的臨床環(huán)境中，細(xì)胞在給藥前不需要洗滌或進(jìn)一步處理。
由于低溫保存存在許多問題，因此應(yīng)考慮保存或儲存細(xì)胞治療產(chǎn)品的替代方案，如凍干。目前并沒有取得多大的成功，但據(jù)說Prestige Lyotechnology能在室溫下保存細(xì)胞，Petaka培養(yǎng)基(Celartia)能在室溫下保存兩周。另一種可能的補救方法是DMSO-free低溫保護(hù)劑，如PRIME-XV FreezIS DMSO-free (Irvine Scientific；MSCs市場)，特別是針對那些由于DMSO暴露而導(dǎo)致效力降低的細(xì)胞類型。
然而，這些冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞回收方面可能不太有效，并且必須針對任何特定的CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)進(jìn)行測試。諸如ThawSTAR(BioCision)或VIA freeze(Asymptote)等受控解凍裝置的進(jìn)步是用于標(biāo)準(zhǔn)化解凍過程的小瓶和袋子的自動化系統(tǒng)。隨著生物保存技術(shù)的可持續(xù)性和標(biāo)準(zhǔn)化的增加，認(rèn)識到CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)運輸和儲存方面取得的進(jìn)步也很重要。所謂的智能托運人(EVO Shipper，BioLife Solutions)擁有各種傳感器，能夠利用全球定位系統(tǒng)來跟蹤產(chǎn)品。
自動液氮冷凍機(jī)可快速檢索產(chǎn)品(Biostore III，Brooks)，確?？勺匪菪圆⑾c搜索產(chǎn)品相關(guān)的任何意外解凍期。雖然已經(jīng)出現(xiàn)了針對CTP的新生物保存解決方案，但仍然存在許多關(guān)于冷凍保存方法的擔(dān)憂。
將不斷增加的生物保存的CTP(細(xì)胞治療產(chǎn)品)整合到常規(guī)臨床應(yīng)用中，提出了新的供應(yīng)鏈和后續(xù)挑戰(zhàn)。雖然不能否認(rèn)CTP保存對環(huán)境和溫度控制系統(tǒng)的需求，但有效的分發(fā)、處理和鏈?zhǔn)奖O(jiān)護(hù)文件對大規(guī)模商業(yè)化是至關(guān)重要的。
對于所有CTPs(細(xì)胞治療產(chǎn)品)，質(zhì)量體系必須記錄鏈?zhǔn)奖O(jiān)護(hù)，從收集細(xì)胞材料開始，然后裝運并運輸?shù)街圃旃S，最后將CTP回輸給患者(圖6)。CTP的供應(yīng)鏈具有挑戰(zhàn)性，因為這些過程發(fā)生在不同的設(shè)施中，并由不同組織的多個人執(zhí)行和處理。因此，需要一種標(biāo)準(zhǔn)化所需數(shù)據(jù)的編譯和收集的穩(wěn)健程序。例如，EVO Shipper(BioLife解決方案)包括云服務(wù)，該服務(wù)集成了熱穩(wěn)定性和精確數(shù)據(jù)管理，用于端到端保護(hù)和患者與制造物流之間CTP的可見性，以及Vineti公司(GE和Mayo Clinic的合資企業(yè))在整個監(jiān)管鏈中提供透明度和可見性，簡化了從收集和調(diào)度到輸液的過程；它整合了物流、制造和臨床數(shù)據(jù)，以提高患者安全性和產(chǎn)品性能。
圖6：細(xì)胞治療產(chǎn)品CTPs的供應(yīng)鏈(圖片來源 nature)
展望
2017年，美國首批兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，分別是Kymriah(諾華)和Yescarta(吉利德)。對于這類和其他有希望的即將到來的細(xì)胞療法，生物制造工程將在產(chǎn)品質(zhì)量和成本方面產(chǎn)生重大影響。
可擴(kuò)展性，希望廣泛(商業(yè))傳播和隨后的規(guī)模經(jīng)濟(jì)使治療價格適中，即使是對于在人類中進(jìn)行概念驗證測試的早期療法，也應(yīng)予以考慮。銷售商品的成本正變得越來越明顯，尤其是在新的審批項目設(shè)定的初始價格區(qū)間從9.3萬美元到66.5萬美元不等。
隨著越來越多的商業(yè)化產(chǎn)品投放市場，報銷機(jī)構(gòu)開始描繪成本與價值的關(guān)系。在定價方面，該行業(yè)仍然不成熟。而降低銷售成本通常需要提高現(xiàn)有的生物制造效率，并且只有在治療接近關(guān)鍵臨床研究時才會大力強(qiáng)調(diào)。
標(biāo)準(zhǔn)方法包括將制造過程解構(gòu)為單元操作，然后根據(jù)三組參數(shù)分析每個單元操作：輸入材料、人工，設(shè)備管理費用和時間(圖7)。在使用低效生物過程的早期制造階段，例如PSC分化，成本的主要組成部分在于勞動力和設(shè)備管理費用。在后期階段，通過使用自動化處理平臺和定義工序公差，可以顯著降低銷售成本。通過降低商品成本來推動現(xiàn)有技術(shù)的線性擴(kuò)展以滿足目標(biāo)產(chǎn)品概況的商業(yè)組件。雖然生物工程的創(chuàng)新可能會產(chǎn)生新的知識產(chǎn)權(quán)障礙，但這些障礙也可能通過提供具有競爭力的成本/處理方程式，顯著的影響其適用性。
圖7：細(xì)胞療法轉(zhuǎn)化到臨床上的分段成本(圖片來源 nature)
許多現(xiàn)有的方法在臨床測試中的適應(yīng)性非常好，但最終會在臨床試驗后的病人負(fù)荷的重壓下屈服。對于成功的制造，需要考慮四個關(guān)鍵因素：質(zhì)量、銷售成本、可擴(kuò)展性和可持續(xù)性。這四個參數(shù)應(yīng)該被用于細(xì)胞治療的開發(fā)過程中，以減輕與擴(kuò)大規(guī)模過程相關(guān)的問題。而自動化流程可以放大生物加工工具開發(fā)所帶來的收益，以達(dá)到可擴(kuò)展性和持續(xù)性，最大限度地降低成本和出錯的可能性。
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