血液腫瘤是一類具有高度異質(zhì)性的疾病，其診療需要結(jié)合形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行綜合分析。二代測序（Next-generation sequencing, NGS）作為新的分子生物學(xué)技術(shù)，具有通量高、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢，是探索血液腫瘤的分子發(fā)病機制并指導(dǎo)臨床診療的重要手段。為推動NGS在血液腫瘤診療中的應(yīng)用，提高診療水平，中國抗癌協(xié)會血液腫瘤專業(yè)委員會、中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會組織國內(nèi)相關(guān)的血液、病理和檢驗專家，結(jié)合國外權(quán)威資料和已積累的大樣本數(shù)據(jù)，制訂了NGS在血液腫瘤中應(yīng)用的中國專家共識。
血液腫瘤中常見的分子生物學(xué)異常主要包括基因突變、融合基因及基因異常表達(dá)。目前NGS在基因突變的檢測方面應(yīng)用最為廣泛和成熟，本共識僅涉及基因突變的檢測。
基因突變的檢測在急性髓系白血病（AML）伴重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常、遺傳易感性髓系腫瘤、骨髓增殖性腫瘤（MPN）、骨髓增生異常綜合征伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞（MDS-RS）、毛細(xì)胞白血病（HCL）和淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥（LPL/WM）的診斷中具有關(guān)鍵性的作用，對于其他血液腫瘤則起到輔助診斷的作用[1,2,3,4,5,6,7,8]。
基因突變是各類血液腫瘤預(yù)后判斷的重要依據(jù)，目前NCCN指南已提出了基于基因突變的AML預(yù)后分層體系[1]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大顆粒淋巴細(xì)胞白血?。↙GLL）中，已經(jīng)證實了一些具有明確預(yù)后意義的突變基因[2,3,4,5,6,7,8]。其他血液腫瘤中突變基因的預(yù)后意義尚有待于進(jìn)一步研究。
一方面，基因突變檢測可提供分子治療靶點，對應(yīng)靶向藥物進(jìn)行治療，目前已有基于突變基因的靶向藥物應(yīng)用于臨床或處于臨床試驗階段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信號通路相關(guān)的突變基因已有靶向藥物上市[1,4,5]；另一方面，基因突變可以導(dǎo)致對某些藥物的敏感或者耐受，及時檢測有助于治療方案的調(diào)整。例如，TP53突變的CLL/SLL患者對常規(guī)化療反應(yīng)差，MYD88和CXCR4基因突變可影響伊布替尼在LPL/WM中的治療效果，ABL1激酶區(qū)突變是慢性髓性白血?。–ML）和Ph ALL酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐受的主要機制之一[4,7,8]。
基因突變是MRD監(jiān)測的分子標(biāo)志物之一[9]。雖然實時定量PCR方法和流式細(xì)胞學(xué)是目前主流的MRD監(jiān)測方法，但是由于NGS靈敏度隨測序深度加深可進(jìn)一步提高，在MRD監(jiān)測方面具有更大的優(yōu)勢。
血液腫瘤在發(fā)展過程中會伴隨動態(tài)的克隆演變，或是基因突變負(fù)荷的改變，或是新的突變基因的出現(xiàn)，及時監(jiān)測基因改變，有助于了解疾病進(jìn)展并調(diào)整治療方案[10]。
血液腫瘤相關(guān)檢測基因由臨床血液腫瘤專家和實驗室專家共同制定，主要依據(jù)中國抗癌協(xié)會、中華醫(yī)學(xué)會、WHO、NCCN等機構(gòu)發(fā)布的血液系統(tǒng)疾病診療指南或者專家共識。對于其他權(quán)威文獻(xiàn)報道的重要基因，可在驗證之后納入基因列表。血液腫瘤易感的胚系突變基因，根據(jù)檢測需求可以納入，例如CEBPA、DDX41、RUNX1、ETV6、GATA2等基因除了可發(fā)生體細(xì)胞突變外，發(fā)生胚系突變可導(dǎo)致髓系腫瘤的易感[2,4]。檢測基因的數(shù)量應(yīng)在滿足臨床需求的基礎(chǔ)上，綜合疾病類型、實驗技術(shù)、樣本數(shù)量以及檢測成本達(dá)到最優(yōu)化的設(shè)計[11,12]。隨著基礎(chǔ)及臨床研究的不斷深入，檢測的基因種類亦需隨之更新。
被檢測的基因所覆蓋區(qū)域可參考臨床診療指南、權(quán)威數(shù)據(jù)庫、文獻(xiàn)及實驗室自建數(shù)據(jù)庫等。首先應(yīng)納入基因熱點突變區(qū)域或重要結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)域，例如NPM1基因c.860_863為熱點突變區(qū)域，NOTCH1基因突變最多見于HD結(jié)構(gòu)域及ΔPEST結(jié)構(gòu)域[13]；無明確熱點突變區(qū)域或突變位點分布比較分散的基因，應(yīng)檢測全部外顯子，例如TP53、RUNX1等；剪接位點突變有可能導(dǎo)致外顯子跳躍，影響蛋白功能，建議根據(jù)數(shù)據(jù)庫記錄和文獻(xiàn)報道將剪接位點±5 bp的區(qū)域納入檢測范圍；對于存在非翻譯區(qū)（UTR）突變的基因，例如BCL6，則應(yīng)納入相應(yīng)區(qū)域檢測[14]。需要注意的是，對于不能覆蓋的熱點突變類型或重要區(qū)域可通過其他檢測方法進(jìn)行補充，并在檢測報告中明確說明。
疑診為血液腫瘤的患者，初診時應(yīng)留存新鮮骨髓、外周血或組織樣本，以備進(jìn)行NGS檢測，未留存者可使用初診時的骨髓涂片進(jìn)行檢測。骨髓采集量以1~3 ml為宜，外周血采集量3~5 ml為宜，若白細(xì)胞計數(shù)偏高或偏低，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整采集量，使單個核細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1×107以上?？鼓齽┦走xEDTA抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝劑，禁止使用肝素抗凝，推薦24 h內(nèi)4 ℃冷藏運送。福爾馬林固定后的組織標(biāo)本需選擇腫瘤成分，切片厚度8~10 μm，5~8片為宜，常溫運輸。已染色標(biāo)本不推薦進(jìn)行NGS檢測。條件允許的病例，可從同一患者采取正常組織作為胚系突變對照。
DNA質(zhì)量是NGS檢測成功的關(guān)鍵因素，同一患者的不同病灶組織、不同組織切片應(yīng)分別單獨進(jìn)行DNA提取，并對DNA質(zhì)量進(jìn)行評估，包括濃度、純度和完整性分析。由于FFPE組織標(biāo)本以及骨髓涂片所提取的DNA易片段化，且因保存環(huán)境及保存時間不同，導(dǎo)致DNA片段化的程度參差不齊，因此各實驗室應(yīng)具有相應(yīng)的方法檢測DNA的完整性或降解程度，并設(shè)立明確的合格樣本標(biāo)準(zhǔn)[11]。
文庫制備用于目標(biāo)區(qū)域的富集，主要有雜交捕獲法和擴增子建庫法，無論采用何種方法制備文庫，均需使用已驗證過的建庫試劑[15]。多標(biāo)本同時測序應(yīng)有相應(yīng)的分子標(biāo)簽用于區(qū)分不同的測序標(biāo)本，明確不同的檢測標(biāo)本和分子標(biāo)簽的一一對應(yīng)關(guān)系；必要時，可對加標(biāo)簽的方法及試劑進(jìn)行說明[16]。文庫濃度過高會導(dǎo)致多克隆數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，降低有效測序數(shù)據(jù)量；過低會導(dǎo)致整體測序數(shù)據(jù)的減少，因此在測序之前推薦使用實時定量PCR或其他方法對文庫進(jìn)行定量，將文庫濃度調(diào)整至合適的水平。每個檢測項目應(yīng)設(shè)定其文庫質(zhì)量的要求，并設(shè)立明確的合格文庫標(biāo)準(zhǔn)。
目前測序主要有電位檢測和光學(xué)檢測兩種基本原理，檢測DNA合成過程中釋放的氫離子或熒光信號。為保證測序質(zhì)量、檢測區(qū)域覆蓋深度及報告時效性，需要根據(jù)樣本數(shù)量和質(zhì)量選取適當(dāng)?shù)臏y序平臺和芯片。
由測序平臺產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)通常會存在堿基召回錯誤、插入刪除錯誤、低質(zhì)量讀段（reads）及接頭污染等問題，會在一定程度上影響下游的分析過程。因此，在對測序結(jié)果進(jìn)行具體的生物信息學(xué)分析之前，要先對下機數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，制定有效的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，包括堿基的質(zhì)量Q20、目標(biāo)區(qū)域平均測序深度、均一性等評價參數(shù)。血液腫瘤的基因突變檢測，測序深度應(yīng)≥500×，平均測序覆蓋度、均一性以及在靶率均≥90%。
低質(zhì)量讀段會影響下游的序列處理和分析，因此需要對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理。數(shù)據(jù)過濾所針對的讀段主要有四種：測序質(zhì)量低的讀段（low quality reads），重復(fù)讀段（duplicate reads），含有核苷酸的插入、刪除和替換等錯誤的讀段（insertion/deletion/mismatch）和帶有人工污染的讀段（adaptor等）。常用的數(shù)據(jù)過濾軟件有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGS QC Toolkit等。
當(dāng)讀段經(jīng)過質(zhì)控與過濾等步驟達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之后，需要將其比對到參考基因組上。目前普遍參考的人類基因組參考序列為Human hg19。不同的比對方法根據(jù)不同的比對策略設(shè)計了不同的算法，常用的比對程序軟件有MAQ、BWA、Bowtie/Bowtie2、SOAP/SOAP2、mrFAST和Stampy等，實驗室應(yīng)當(dāng)選取合適的比對軟件，建立完善的實驗室比對流程。
突變位點識別常借助于Samtools、GATK等識別工具。對突變位點的注釋內(nèi)容包括功能信息、頻率信息、軟件預(yù)測結(jié)果信息以及疾病數(shù)據(jù)庫信息，常用的包括Ensembl、RefSeq、GENCODE、dbSNP、1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphen和SIFT等。
篩選與鑒別疾病相關(guān)突變位點需要經(jīng)過嚴(yán)格的篩選流程，至少需要排除低質(zhì)量變異、未有明確意義的非編碼區(qū)變異、同義單核苷酸變異（SNV）及已知健康人群中的基因多態(tài)性位點。
報告中除患者信息、標(biāo)本信息、送檢日期、報告署名及日期等一般資料外，還應(yīng)包括：檢測基因列表、檢測區(qū)域及突變類型；使用的檢測平臺、目標(biāo)區(qū)域的富集方法、平均測序深度、數(shù)據(jù)分析軟件名稱及版本號；對相關(guān)專業(yè)術(shù)語進(jìn)行解釋說明；本實驗室報告突變位點的規(guī)則、檢測方法的局限性、檢測靈敏度和準(zhǔn)確度等；注明是否通過其他方法補充了NGS未覆蓋或覆蓋不佳的檢測區(qū)域等[11,16]。
突變位點信息應(yīng)該包括基因名稱、突變的物理坐標(biāo)、cDNA的轉(zhuǎn)錄本號、外顯子位置、符合人類基因組變異協(xié)會（HGVS）書寫規(guī)范的突變類型、氨基酸突變類型、變異等位基因頻率以及該突變位點的測序深度等[17]。參考序列推薦使用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information）收錄的參考序列。當(dāng)使用各基因編碼DNA參考序列描述突變時，推薦最常使用的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄本（canonical sequence）[18]。
不推薦將良性或可能良性突變在報告中報道。建議突變位點根據(jù)臨床意義的明確性進(jìn)行分級報告：
①一級變異：具有明確臨床意義的突變，包括：國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）、美國食品藥品管理局（FDA）等機構(gòu)批準(zhǔn)的用藥治療靶點；血液腫瘤診療指南或?qū)＜夜沧R中有明確診斷、治療、預(yù)后意義的突變；尚未進(jìn)入診療指南或?qū)＜夜沧R，但有權(quán)威文獻(xiàn)或大規(guī)模報道在血液腫瘤中具有診療意義的突變。
②二級變異：具有潛在臨床意義的突變，包括：基于多個小規(guī)模研究報道在血液腫瘤中具有診斷、治療或預(yù)后意義，但尚未達(dá)成共識的突變；新發(fā)現(xiàn)的疾病相關(guān)基因重要結(jié)構(gòu)域的體細(xì)胞突變。
③三級變異：臨床意義未明的突變，對于尚有爭議的突變位點，實驗室必須制定相關(guān)規(guī)則，可以發(fā)現(xiàn)突變即報告，并附上說明和意義；也可以不報告或只報告小部分突變結(jié)果，并附上說明、參考文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫。
突變位點的臨床意義解讀要平實客觀、清晰易懂。推薦寫明突變位點的人群突變頻率、蛋白功能危害性預(yù)測和疾病數(shù)據(jù)庫的記錄，根據(jù)疾病診療指南、專家共識和既往研究說明突變位點在臨床診斷、治療和預(yù)后評估中的意義，注明其相關(guān)藥物及正在開展的狀態(tài)信息，并附上數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)來源。對于胚系突變，除了疾病診療指南及重要參考文獻(xiàn)外，推薦參考OMIM、HGMD和ACMG等數(shù)據(jù)庫或?qū)W術(shù)機構(gòu)中遺傳疾病變異分類指導(dǎo)注釋臨床意義，并附上數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)來源。陰性結(jié)果并不能完全排除患者不存在基因突變，可能是由于檢出靈敏度或檢測區(qū)域局限性所致，報告中應(yīng)當(dāng)以醫(yī)師可以理解的方式對此予以說明[19]。
NGS檢測實驗室的總體設(shè)計與要求應(yīng)參考《分子病理診斷實驗室建設(shè)指南（試行）》、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》等行業(yè)文獻(xiàn)和要求。檢測人員、生物信息分析人員、報告分析人員和提供咨詢?nèi)藛T應(yīng)具備相應(yīng)專業(yè)背景且經(jīng)過相應(yīng)培訓(xùn)取得上崗資質(zhì)[20]。實驗室區(qū)域設(shè)置和環(huán)境需要滿足實驗環(huán)節(jié)和儀器要求。NGS檢測試劑及測序平臺應(yīng)首選CFDA認(rèn)可的產(chǎn)品。涉及實驗室自配試劑、探針等，應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），并經(jīng)過臨床實驗室自建項目（LDT）驗證合格后方可使用[11,18,21,22]。
NGS實驗室應(yīng)建立質(zhì)量管理體系，對于標(biāo)本采集和處理、實驗操作、生物信息分析和報告分析各個環(huán)節(jié)均需要建立SOP文件，實驗操作程序和生物信息分析須經(jīng)過性能驗證或確認(rèn)[15]。
注：AML：急性髓系白血??；ALL：急性淋巴細(xì)胞白血?。籑DS：骨髓增生異常綜合征；MPN：骨髓增殖性腫瘤
實驗環(huán)節(jié)需要設(shè)置陰/陽性對照[11,18]。陽性對照一般采用包含已知突變信息的混合樣本作為質(zhì)控材料，并且其中應(yīng)當(dāng)包含最低檢測限的突變位點，實驗時同時進(jìn)行檢測，以確保其檢出能力。陰性對照一般采用明確無突變或無核酸的樣本作為質(zhì)控材料，實驗時同時進(jìn)行檢測，以確保實驗過程中無污染及無非特異性。
實驗室應(yīng)定期參加相應(yīng)檢測項目的室間質(zhì)量評價或能力驗證；若無法實現(xiàn)，應(yīng)通過與其他實驗室（如使用相同檢測系統(tǒng)的實驗室）比對的方式，判斷檢驗結(jié)果的可接受性。
樣本質(zhì)量問題、檢測過程的不確定因素以及數(shù)據(jù)分析可能存在的漏洞，都可能導(dǎo)致檢測結(jié)果中存在假陽性或者假陰性。實驗室需要確定適宜的cut off值，在cut off值以上的結(jié)果可以采用自動化結(jié)果，但若出現(xiàn)比較疑似單堿基插入或缺失的未知突變，建議進(jìn)行人工核對，并采用Sanger測序、ARMS-PCR、數(shù)字PCR等方法進(jìn)行驗證。而對于cut off值以下的有意義位點必須進(jìn)行人工核對，同時采用ARMS-PCR、數(shù)字PCR或二次建庫/測序方法進(jìn)行驗證[18]。很多實驗室的NGS測序平臺都可能會出現(xiàn)一定數(shù)量的'實驗室特異性'的突變，此類突變是該檢測系統(tǒng)特有的假陽性突變，應(yīng)在報告時予以剔除。
信息系統(tǒng)的功能應(yīng)滿足臨床需要，包括數(shù)據(jù)分析、存儲、傳輸及安全性等。生物信息分析流程應(yīng)包括所有的算法、軟件、腳本、參考序列和數(shù)據(jù)庫，可以是內(nèi)部的、供應(yīng)商開發(fā)的或開源的。實驗室應(yīng)有記錄NGS生物信息分析步驟的書面程序用來分析、解釋、報告NGS檢測結(jié)果，且針對每份NGS病例數(shù)據(jù)分析報告，需要設(shè)立追溯機制，確保檢測中涉及的生物信息數(shù)據(jù)分析流程能夠追溯[11,15]。實驗室應(yīng)規(guī)定原始序列核心數(shù)據(jù)的保存期限，并在醫(yī)師要求或患者檢測需要時，允許實驗室間重新分析、重新注釋及重新解釋。同時應(yīng)確保NGS數(shù)據(jù)內(nèi)部和/或外部存儲、轉(zhuǎn)移的保密性以及數(shù)據(jù)的完整性。
隨著分子生物學(xué)在血液腫瘤發(fā)病機制和臨床診療研究的不斷深入，NGS在血液腫瘤中的應(yīng)用將會越來越廣泛和高效。本共識闡述了NGS在血液腫瘤中應(yīng)用的基本原則和總體流程，并對血液腫瘤的臨床診療提供有效幫助。NGS在未來的技術(shù)、分析內(nèi)容和結(jié)果解讀方面會不斷進(jìn)步和完善，在血液腫瘤的實踐應(yīng)用過程中也會帶來各種挑戰(zhàn)。
參與共識討論的專家：哈爾濱血液病腫瘤研究所（馬軍、邱林）；吉林大學(xué)第一醫(yī)院（白鷗）；中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛（劉卓剛、張繼紅）；北京大學(xué)第一醫(yī)院（任漢云）；解放軍總醫(yī)院（高春記）；北京協(xié)和醫(yī)院（陳杰、梁智勇、周道斌）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院（周洲）；中國食品藥品檢定研究院（黃穎）；中國合格評定國家認(rèn)可委員會（周亞莉）；衛(wèi)生部臨床檢驗中心（彭明婷）；北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院（朱軍）；北京大學(xué)人民醫(yī)院（秦亞溱）；北京大學(xué)第三醫(yī)院（克曉燕）；山西省腫瘤醫(yī)院（蘇麗萍）；山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（楊林花、王晨）；河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院（劉紅星）；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（羅建民）；（高廣勛、王哲）；山東省立醫(yī)院（王欣）；山東大學(xué)齊魯醫(yī)院（侯明、紀(jì)春巖）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（趙維蒞）；海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院（楊建民、何妙俠）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院（侯?。?；復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（杜祥）；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院（劉澎、侯英勇）；江蘇省人民醫(yī)院（喬純、李建勇）；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院（吳德沛、陳蘇寧）；江蘇省臨床檢驗中心（許斌）；南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院（樊祥山）；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（李振宇、桑威）；安徽省立醫(yī)院（孫自敏）；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（曾慶曙）；福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院（胡建達(dá)）；廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院（徐兵）；河南省腫瘤醫(yī)院（宋永平）；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（姜中興）；河南省人民醫(yī)院（孫愷）；華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院（胡豫）；華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院（周劍峰）；武漢大學(xué)中南醫(yī)院（左學(xué)蘭）；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院（趙謝蘭）；暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所（李揚秋）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院（劉啟發(fā)、梁莉）；廣東省人民醫(yī)院（杜欣、翁建宇）；深圳市第二人民醫(yī)院（杜新）；南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（李玉華）；重慶醫(yī)科大學(xué)（丁克越）；陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院（張曦、郭喬楠）；四川大學(xué)華西醫(yī)院（牛挺、劉衛(wèi)平）；陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院（陳潔平）；四川省人民醫(yī)院（黃曉兵）；重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（劉林）；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（鄭波）；青海省人民醫(yī)院（李文倩）；云南省人民醫(yī)院（楊同華）；昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（周澤平）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院（王曉敏）；海南省人民醫(yī)院（姚紅霞）；天津市臨床檢驗中心（楊彬）；天津市腫瘤醫(yī)院（張會來、李曉玲）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（藺亞妮、張冬雷、朱平、魏輝、邱錄貴、肖志堅、王建祥、汝昆）
（執(zhí)筆：藺亞妮、張冬雷、朱平、劉紅星、丁克越、喬純、彭明婷、汝昆）
聯(lián)系客服
