解螺旋公眾號·陪伴你科研的第2114天
上世紀(jì)二十年代，Warburg發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也趨向于通過糖酵解提供能量，即“有氧糖酵解”。隨后，這一現(xiàn)象被命名為“Warburg效應(yīng)”，Warburg也因為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呼吸代謝的本質(zhì)而獲得1931年諾貝爾生理學(xué)獎。幾十年來，很多研究從能量代謝的角度揭示了腫瘤細(xì)胞做出如此“下策”的原因。但今天，我們的主角并不是能量，而是一直被人們認(rèn)為是“代謝廢棄物”的糖酵解產(chǎn)物——乳酸（lactic acid）。在中學(xué)的時候，乳酸一詞對我們已經(jīng)不算陌生。豐富的生活經(jīng)驗告訴我們，在劇烈運(yùn)動之后，肌肉細(xì)胞無氧代謝產(chǎn)生的乳酸會讓我們產(chǎn)生酸痛感。很多研究從代謝角度揭示了乳酸的諸多功能，涉及到了多個領(lǐng)域。但人們從未發(fā)現(xiàn)乳酸參與的表觀遺傳修飾。在這篇于2019年10月23日在線發(fā)表于Nature的文章中，芝加哥大學(xué)趙英明教授首次報道了組蛋白H3K18乳酸化修飾。這一發(fā)現(xiàn)不僅為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究開辟了新領(lǐng)域，也為代謝產(chǎn)物乳酸在腫瘤、免疫領(lǐng)域參與的研究指引了新方向。趙英明教授的課題組在先前的研究中開發(fā)出了一種基于質(zhì)譜技術(shù)尋找新的質(zhì)量偏移的軟件工具——PTMap。在此基礎(chǔ)上，趙教授鑒定出一系列?；饔?，極大豐富了人們對于“組蛋白密碼”的認(rèn)識。本文的研究也始于在MCF7核心組蛋白水解肽段的LC-MS/MS實驗中檢測到的質(zhì)量偏移，而且偏移的質(zhì)量為72.021道爾頓。因此作者推測可能是由于在賴氨酸上添加了乳酸基團(tuán)所致，并通過人工合成肽段和體內(nèi)分離肽段進(jìn)行質(zhì)譜圖譜對比，從而證實了這一猜想（Fig.1a-b）。在此基礎(chǔ)上，作者通過質(zhì)譜分析分別鑒定出人Hela細(xì)胞中的26個組蛋白乳酸化修飾位點和小鼠BMDMs細(xì)胞中的16個組蛋白乳酸化修飾位點（Fig.3c）。明確組蛋白乳酸化（H3K18la）存在后，接下來顯而易見的問題便是乳酸化修飾所用的乳酸從哪里來？為此，作者用多種葡萄糖濃度處理MCF7細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)乳酸的產(chǎn)生和H3K18la修飾水平都呈劑量依賴型增加（Fig.2a-b）。使用不可代謝的葡萄糖類似物2-脫氧葡糖（2-DG）則對乳酸產(chǎn)生和H3K18la修飾都不產(chǎn)生影響（Fig.2c-d）。而體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生量由糖酵解和線粒體代謝之間的平衡決定，為此作者檢測了這兩個通路中的關(guān)鍵酶活性對乳酸水平和H3K18la的影響（Fig.2e）。結(jié)果表明，在使用糖酵解中的兩個抑制劑——二氯乙酸鈉（Sodium dichloroacetate, DCA）和草氨酸鹽（Oxamate）后，細(xì)胞內(nèi)乳酸水平（Fig.2f）和H3K18la水平顯著下降（Fig. 2g-h），而線粒體代謝抑制劑——魚藤酮（Rotenone）處理后，細(xì)胞內(nèi)乳酸水平（Fig.2f）和H3K18la水平均顯著升高（Fig.2i）。Figure 2：乳酸調(diào)控組蛋白乳酸化水平為了進(jìn)一步探究病理狀態(tài)下糖酵解變化對乳酸水平和H3K18la水平的影響，作者選取了缺氧和M1型巨噬細(xì)胞極化兩個模型進(jìn)行研究。已有研究表明，在缺氧應(yīng)答中，細(xì)胞通過抑制氧化磷酸化和增強(qiáng)糖酵解實現(xiàn)代謝重編程，這刺激了乳酸的產(chǎn)生。作者發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞內(nèi)源性乳酸水平（Fig.2j）和H3K18la水平的增加（Fig.2k）。已有研究表明，M1型巨噬細(xì)胞極化過程中經(jīng)歷代謝重編程進(jìn)行有氧糖酵解，產(chǎn)生乳酸；而M2型巨噬細(xì)胞極化過程中則增強(qiáng)了有氧磷酸化和脂肪酸代謝。為了驗證這一假設(shè)，作者用LPS和IFN-γ處理了小鼠BMDMs，檢測了乳酸水平和H3K18la水平隨時間變化的動力學(xué)特征。結(jié)果表明從處理后16 h開始，乳酸水平和H3K18la水平開始顯著上升（Fig.3a-c）。而且，這種作用僅在M1型巨噬細(xì)胞極化中發(fā)生（Fig.3d）。很多研究表明，組蛋白修飾在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。為探究在H3K18la修飾形成（即處理24 h使H3K18la修飾水平達(dá)到較高水平）后，其對基因表達(dá)的影響。作者首先使用H3K18la和H3K18ac特異性抗體進(jìn)行了ChIP-seq和ChIP-qPCR實驗，結(jié)果表明處理后水平升高2倍的H3K18la水平所修飾的基因顯著多于H3K18ac，而且H3K18la修飾的基因中大部分不會存在H3K18ac修飾（Fig.3e-f）。為了進(jìn)一步探明H3K18la修飾對基因表達(dá)的影響，作者進(jìn)行了RNA-seq和動力學(xué)分析實驗。結(jié)果表明在LPS和IFN-γ處理后的4 h起，炎癥應(yīng)答基因（例如Nos2）就已經(jīng)開始上調(diào)，在16-24 h內(nèi)降低到一定水平（Fig.3g）。與此同時，被H3K18la特異性修飾的一類基因（例如ARG1）主要在16-24 h內(nèi)開始顯著上調(diào)（Fig.3h）。有趣的是，這類上調(diào)的基因主要富集在M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的“wound healing”通路。為了更充分模擬生理過程，作者使用革蘭氏陰性菌處理小鼠BMDMs激活M1型巨噬細(xì)胞極化，同樣誘導(dǎo)了乳酸水平和H3K18la修飾水平的上升（Fig.3i-j）。Figure 3：M1型巨噬細(xì)胞極化中組蛋白乳酸化修飾與M2型基因激活相關(guān)
巨噬細(xì)胞極化過程中，精氨酸的分解代謝和合成代謝十分關(guān)鍵。研究表明M1型巨噬細(xì)胞含有低水平的ARG1，通過一氧化氮合酶產(chǎn)生一氧化氮代謝精氨酸，殺死病原體。而M2巨噬細(xì)胞有高水平的ARG1，產(chǎn)生鳥氨酸促進(jìn)傷口愈合。因此，作者驗證了M1型巨噬細(xì)胞中ARG1和Nos2的動力學(xué)變化。結(jié)果表明在M1極化后24-48 h，ARG1蛋白水平和活性顯著增加，而NOS2蛋白水平和功能在M1極化12 h后達(dá)到峰值，并在以后的時間點下降。上述的實驗結(jié)果表明，炎癥刺激后期M1型巨噬細(xì)胞中的H3K18la修飾與一系列M2型基因的表達(dá)激活相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證這一點，作者通過直接控制M1型巨噬細(xì)胞中乳酸水平觀察M2型基因的表達(dá)變化。一方面，作者通過敲除LDHA（乳酸脫氫酶）降低M1細(xì)胞中乳酸水平和H3K18la修飾水平（Fig.4a-b），結(jié)果表明ARG1表達(dá)顯著降低（Fig.4c），ARG1啟動子區(qū)域的H3K18la修飾水平也顯著降低（Fig.4d）；另一方面，作者通過添加外源性乳酸提高M(jìn)1巨噬細(xì)胞中乳酸水平和H3K18la修飾水平（Fig.4e-f），結(jié)果表明ARG1表達(dá)顯著上調(diào)（Fig.4g），ARG1啟動子區(qū)域的H3K18la修飾水平也顯著提高（Fig.4h）。Figure 4：乳酸通過組蛋白乳酸化修飾介導(dǎo)M2型基因表達(dá)綜上所述，作者的研究表明，在M1型巨噬細(xì)胞極化過程中發(fā)生的有氧糖酵解啟動了一個“乳酸時鐘”。該時鐘通過介導(dǎo)組蛋白H3第18位賴氨酸的乳酸化修飾在M1型巨噬細(xì)胞極化晚期誘導(dǎo)M2型基因表達(dá)。這可能發(fā)揮了平衡巨噬細(xì)胞極化的作用，有助于宿主在感染過程中進(jìn)行組織修復(fù)，緩解炎癥帶來的組織損傷。讀完這篇文章，說實話筆者內(nèi)心還是有一些小遺憾。本文兩位通訊作者中，趙英明教授實驗室主要通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了組蛋白乳酸化修飾這種全新的表觀修飾方式；而另一位通訊作者Lev Becker教授的研究領(lǐng)域是巨噬細(xì)胞極化。筆者遺憾的是這種全新的組蛋白乳酸化修飾還沒有在癌癥中被充分驗證，我也十分期待乳酸化——這一似乎與腫瘤發(fā)生發(fā)展十分相關(guān)的表觀修飾能夠為腫瘤領(lǐng)域開拓出新的方向。參考文獻(xiàn)：Zhang D, Tang Z, Huang H, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019;574(7779):575–580. doi:10.1038/s41586-019-1678-1
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