用氣相色譜儀對(duì)篩選的 20 名血液透析患者的糞便進(jìn)行短鏈脂肪酸測(cè)定，得出結(jié)果如表 3-2 所示：基線 V0、干預(yù) V2、V6 期兩兩時(shí)期的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸的對(duì)比的顯著性差異，可看到 V0 和 V2 期的乙酸含量、丙酸含量有顯著性差異（P=0.011、0.035<0.05），V2 期和 V6 期的丁酸含量有顯著性差異（P=0.045<0.05），其它均無(wú)顯著性差異。
3.3.2 益生菌和短鏈脂肪酸相關(guān)性分析。
如表 3-2 所示，益生菌攝入對(duì)腸道短鏈脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）代謝水平的影響。短鏈脂肪酸又名揮發(fā)性脂肪酸，這類脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度在 1-6之間，常見(jiàn)的短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。其主要由結(jié)腸中的厭氧菌發(fā)酵碳水化合物或降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生。短鏈脂肪酸在人體內(nèi)具有重要的生理功能，其可以調(diào)節(jié)人體的腸道菌群多樣性、為腸道上皮細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)腸道細(xì)胞的増殖、減少結(jié)腸炎癥的發(fā)生、抗腫瘤等[88–90]。腸道內(nèi)的益生菌能夠滿足需要時(shí)，就可以對(duì)腸道菌群失調(diào)進(jìn)行改善；之后在體內(nèi)分解，其有效成分能夠被人體吸收，從而促進(jìn)腸道菌群之間的作用，最終對(duì)增強(qiáng)人體免疫力有所作用[91]。
2005 年 Schneider 等人以患有腸道疾病的實(shí)驗(yàn)對(duì)象和健康實(shí)驗(yàn)對(duì)象為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，讓上述兩組人群連續(xù) 6 天攝入益生菌布拉氏酵母菌研究攝入該益生菌兩組人群腸道中短鏈脂肪酸的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攝入益生菌后，患病組實(shí)驗(yàn)對(duì)象腸道中短鏈脂肪酸生成量顯著增加，健康組實(shí)驗(yàn)對(duì)象沒(méi)有特別大的變化。益生菌對(duì)樣品糞便中的乙酸、丙酸、丁酸含量有影響，并以 V2 期最為顯著。說(shuō)明在干預(yù)兩個(gè)月以后達(dá)到益生菌對(duì)短鏈脂肪酸的影響。
3.3.3 血液透析便秘患者糞便 16s 高通量測(cè)序分析。
3.3.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控。
?。?）測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)：① 濾 reads 尾部的質(zhì)量值是 20 以下的堿基，設(shè)置 50bp 的窗口且平均質(zhì)量值低于20，就從窗口開(kāi)始截去后端堿基，之后再過(guò)濾質(zhì)控后 50bp 以下的 reads，去除含 N 堿基的 reads；② 根據(jù) PE reads 之間的 overlap 關(guān)系，將成對(duì) reads 拼接(merge)成一條序列，最小 overlap 長(zhǎng)度為 10bp；③ 接序列的 overlap 區(qū)可以允許為 0.2 的最大錯(cuò)配比率，以用來(lái)篩選出不符合的序列；④ 基于序列首尾兩端的 barcode 和引物區(qū)別樣品，然后調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為 0，并且最大引物錯(cuò)配數(shù)為 2；使用軟件：FLASH、Trimmomatic。
（2）樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
?、贉y(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以 16s 基因序列為基礎(chǔ)的測(cè)序方法，用來(lái)比較血液透析患者和干預(yù) V2、V6時(shí)期為對(duì)照組的腸道微生物群落。從他們的糞便樣本中提取 DNA，表 3-3 所示共獲得 2226553 個(gè)高質(zhì)量的 16srDNA 基因序列，平均每個(gè)樣本序列為 37109 條基因序列，樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)量最大序列為 44551 條，最小序列為 30055 條，樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息見(jiàn)附錄三。
?、跇颖緮?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)樣本信息的總覽，包括樣本和測(cè)序相關(guān)信息，附錄 3。
3.3.3.2 物種注釋與評(píng)估。
OUT 的定義是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，人為的給某一個(gè)分類單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置了統(tǒng)一的標(biāo)志。然后將序列按照彼此相似性分類和歸納為許多不同的小組，進(jìn)行聚類分析操作，其中一個(gè) OTU 就是一個(gè)小組。基于相似度水平的不同，對(duì)所得序列進(jìn)行 OTU 分類，一般是相似水平為 97%的條件下的 OUT 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。分析步驟如下：
?、?為了便于降低分析中間過(guò)程中冗余計(jì)算量，要對(duì)優(yōu)化的序列再提取非重復(fù)序列；② 去除沒(méi)有重復(fù)的單序列；③ 按照 97%相似性對(duì)非重復(fù)序列來(lái)進(jìn)行 OTU 聚類，在聚類過(guò)程中要去除嵌合體，從而得到 OTU 的代表序列。采用 RDP classifier 貝葉斯算法，然后利用這種算法對(duì) 97%相似水平的 OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，得到每個(gè) OTU 對(duì)應(yīng)物種的分類信息，然后分別在各個(gè)分類學(xué)水平下顯示出來(lái)：domain（域），kingdom（界），phylum（門(mén)），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）進(jìn)而統(tǒng)計(jì)各樣本及其各樣本之間的群落組成及差異。
利用 16s 細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)整理功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)，得出結(jié)果。
（1）OTU 分類學(xué)分析。
OTU 分類學(xué)綜合信息表， 將 OTU 分析結(jié)果分類學(xué)信息結(jié)合得到的綜合表，Rank-Abundance 曲線是分析多樣性的一種方式。其構(gòu)建方法是要對(duì)單一樣本中每一個(gè) OTU 所含的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后將 OTUs 按相對(duì)豐度由大到小進(jìn)行排序，以樣本 OTU 等級(jí)為橫坐標(biāo)，以 OTU 中序列數(shù)的相對(duì)百分含量或序列數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行做圖。
（2）Alpha 多樣性分析。
微生物的多樣性是可以通過(guò)單樣本的多樣性來(lái)分析，反映了微生物群落的相對(duì)豐度和微生物的多樣性。多樣性指數(shù)分析是統(tǒng)計(jì)顯示了個(gè)樣本在各個(gè)指數(shù)類型下的多樣性指數(shù)數(shù)值，多樣性指數(shù)表第一列為樣本名，第一行為多樣性指數(shù)類型，其余列為各指數(shù)類型對(duì)應(yīng)的數(shù)值。本研究選取能計(jì)算群落多樣性（Communitydiversity）的 shannon 相濃指數(shù)進(jìn)行分析，圖 3-3 多樣性指數(shù)柱狀圖為 Shannon 均勻度測(cè)量指數(shù)分既指數(shù)越高代表菌群越豐富，顯示基線 V0 期、干預(yù) V2、V6 期相比菌群多樣性差異并不明顯。
（3）指數(shù)組間差異檢驗(yàn)。
通過(guò)多樣性指數(shù)分析可以得到群落中物種的豐度、覆蓋度和多樣性等信息。T檢驗(yàn)，也稱 Student t 檢驗(yàn)，是用 t 分布理論來(lái)推論差異發(fā)生的概率，從而比較兩個(gè)平均數(shù)的差異是否顯著，主要用于樣本含量較?。ɡ?n<30），總體標(biāo)準(zhǔn)差σ未知的正態(tài)分布數(shù)據(jù)。該分析可用于評(píng)估不同分組間多樣性指數(shù)是否有顯著性差異。
如圖 3-4 所示顯示，按時(shí)期和各個(gè)醫(yī)院各個(gè)時(shí)期分析，組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明組內(nèi)差異較大。多樣性指數(shù) T 檢驗(yàn)柱狀圖，此圖展示所選兩組樣本間的顯著性差異情況，并對(duì)有顯著性差異的兩組做好標(biāo)記（0.01<p<=0.05 標(biāo)記為*，0.001<p<=0.01 標(biāo)記為**，p<=0.001 標(biāo)記為***）。
3.3.3.3 物種組成分析。
研究環(huán)境中微生物的多樣性，可以通過(guò)單樣本的多樣性即 alpha 多樣性反映微生物群落的豐度和多樣性，也包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)以估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。
此模塊主要有三個(gè)分析功能，分別是 Alpha 多樣性指數(shù)分析、基于多樣性指數(shù)的組間 T 檢驗(yàn)分析還有稀釋性曲線分析，通過(guò)多樣性指數(shù)分析您可以得到群落中物種的豐度、覆蓋度和多樣性等信息，通過(guò)稀釋性曲線分析您可以了解樣本的測(cè)序深度是否合理。
（1）物種 Venn 圖分析。
Venn 圖可用于統(tǒng)計(jì)多組或多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)樣本的物種數(shù)目組成的相似性和重疊情況。一般情況下，分析時(shí)選用相似水平為 97%的 OTU 或其他分類學(xué)水平的樣本表進(jìn)行分析。
如圖 3-5 所示基線 V0 期、干預(yù) V2、V6 期三個(gè)時(shí)期的菌群數(shù)量為 577 個(gè)，基線 V0 期、干預(yù) V2 期共有菌群數(shù)為 614 個(gè)，基線 V0 期、干預(yù) V6 期共有菌群數(shù)為606 個(gè)，干預(yù) V2 期、干預(yù) V6 期共有菌群數(shù)為 596 個(gè)，只有基線 V0 期有的菌群為12 個(gè)，只有干預(yù) V2 期有的菌群為 6 個(gè)，只有干預(yù) V6 期有的菌群為 16 個(gè)。Venn圖，重疊部分表示多個(gè)樣本分組中共有的物種（或 OTU），沒(méi)有重疊的部分表示該樣本分組所特有的物種（或 OTU），數(shù)字表示對(duì)應(yīng)的物種（或 OTU）數(shù)目。
（2）群落組成分析。
基于分類學(xué)分析的結(jié)果，顯示一個(gè)或多個(gè)樣本在不同分類水平上的分類學(xué)比對(duì)情況。在結(jié)果中，通常包含了兩個(gè)信息：
?、?本中含有何種微生物；② 樣本中的微生物的序列數(shù)，也可看作為各微生物的相對(duì)豐度。
可采用使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的方法，對(duì)樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)以及其變化情況將多個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)放在一起分析對(duì)比進(jìn)行觀測(cè)?；谘芯繉?duì)象的樣本數(shù)量，有不同的方式展示來(lái)展示結(jié)果。一般使用比較直觀的餅圖或柱狀圖等形式進(jìn)行呈現(xiàn)。除此之外群落結(jié)構(gòu)可在任一分類水平下進(jìn)行分析。
?。?）群落 Bar 圖。
基于分類學(xué)分析結(jié)果，顯示得出不同分組也可以是不同樣本在各分類水平（如域、界、門(mén)、綱、目、科、屬、種、OTU 等）上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。根據(jù)群落Bar 圖，可以直觀呈現(xiàn)兩方面信息：
?、俑鳂颖驹谀骋环诸悓W(xué)水平上含有何種微生物；②樣本中各微生物的相對(duì)豐度（所占比重）。
③群落柱形圖，橫坐標(biāo)/縱坐標(biāo)為樣本名，縱坐標(biāo)/橫坐標(biāo)為物種在該樣本中所占的比例，不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長(zhǎng)短代表該物種所占比例的大小。可以通過(guò)點(diǎn)擊圖例中的每個(gè)物種進(jìn)行篩選個(gè)性化查看物種組成情況。
如圖 3-6 所示，在屬水平下基線 V0 期、干預(yù) V2、V6 期的腸道菌群中相對(duì)豐度大于 1%的微生物有 26 種，分別為 Megamonas，Coprococcus_2，F(xiàn)usobacterium，Lachnospira ， Roseburia ， Collinsella ， Alistipes ， Parabacteroides ，Phascolarctobacterium ， Lactobacillus ， [Ruminococcus]_gnavus_group ，[Ruminococcus]_torques_group ， Fusicatenibacter ， Escherichia-Shigella ，Subdoligranulum ，Ruminococcus_2 ， Enterococcus ， [Eubacterium]_hallii_group ，[Eubacterium]_rectale_group ， Streptococcus ， Anaerostipes ， Prevotella_9 ，Bifidobacterium，F(xiàn)aecalibacterium，Bacteroides，Blautia。其中屬于厚壁菌門(mén)有 18種、擬桿菌門(mén) 5 種、變形菌門(mén) 2 種、梭桿菌門(mén) 1 種和變形菌門(mén)一種。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌。
基線 V0 期中，厚壁菌門(mén)（53.9%）包括棲糞桿菌屬（Faecalibacterium,9.0%）、布勞特氏菌屬（Blautia,13.69%），罕見(jiàn)小球菌屬（Subdoligranulum,3.42%），霍氏 真 桿 菌 屬 （ [Eubacterium]_hallii_group ,3.59% ） ， 直 腸 真 桿 菌 屬（[Eubacterium]_rectale_group ,3.78%），丁酸弧菌屬（Anaerostipes,4.97%）、羅斯氏菌屬（Roseburia,0.78%）、毛螺菌屬（Lachnospira,0.75）、乳酸菌屬（ Lactobacillus,1.49% ） ， 腸 球 菌 屬 （ Enterococcus,0.23% ） ， 鏈 球 菌 屬（ Streptococcus,2.95% ）、巨單胞菌屬（ Megamonas,0.16% ）和考拉桿菌屬（ Phascolarctobacterium,0.92% ） 。 擬 桿 菌 門(mén) （ 13.8% ） 包 括 擬 桿 菌 屬（Bacteroides,10.33%），普雷沃氏菌屬（Prevotella_9,2.36%）、Alistipes（1.04%）和副桿狀菌屬（0.07%）。放線菌門(mén)（6.44%）包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium,5.7%）和，柯林斯氏菌（Parabacteroides,0.74%）。最后兩個(gè)為變形菌門(mén)下的腸桿菌（Escherichia-Shigella,3.2%）和梭桿菌門(mén)下的梭桿菌（Fusobacterium,0%）。
與基線 VO 期相比服用菌片干預(yù)兩個(gè)月后，厚壁菌門(mén)（49.52%）有所減少，棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、毛螺菌屬（Lachnospira）和布勞特氏菌屬（Blautia）有所增加，上升到 10.34%、1.17%、1.06%和 14.2%，罕見(jiàn)小球菌屬（Subdoligranulum）、霍氏真桿菌屬（[Eubacterium]_hallii_group）和直腸真桿菌屬（[Eubacterium]_rectale_group）下降到 1.40%、1.94%和 2.39%，乳桿菌屬（Lactobacillus）下降至 0.99%，鏈球菌屬（Streptococcus）是上升至 3.72%，巨單胞菌屬（Megamonas,0%）下降，腸球菌屬（Enterococcus,0.2%），羅斯氏菌屬（Roseburia,1.17%）增加。擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度上升到 21%，擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）上升到 14.48%和 6.52%。放線菌門(mén)（5.68%），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）下降到 3.82%，腸桿菌屬下降到 1.86%。
相較于干預(yù) V2 期，菌片干預(yù)六個(gè)月后，厚壁菌門(mén)（44.8%）含量繼續(xù)下降，包括棲糞桿菌屬（Faecalibacterium,6.32%）、布勞特氏菌屬（Blautia,11.5%），罕見(jiàn) 小 球 菌 屬 （ Subdoligranulum,1.64% ） ， 霍 氏 真 桿 菌 屬（ [Eubacterium]_hallii_group ,1.80% ） ， 直 腸 真 桿 菌 屬（[Eubacterium]_rectale_group ,1.76%），丁酸弧菌屬（Anaerostipes,2.66%）均有所減少，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）和毛螺菌屬（Lachnospira,0.45%）有顯著減少（P<0.05），腸球菌屬（Enterococcus）上升至 6.59%，鏈球菌屬（Streptococcus）持續(xù)上升至 2.43%，乳桿菌屬（Lactobacillus）持續(xù)下降到 0.51%，巨單胞菌屬（Megamonas,1.02%）增加，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）減少。擬桿菌門(mén)下降至 17.57%，擬桿菌屬（Bacteroides）和普雷沃氏菌屬（Prevotella_9）均有所下降，下降為 13.21%和 4.36%。放線菌門(mén)（7.78%）增加，包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）增長(zhǎng)到 6.98%和腸桿菌（Escherichia-Shigella）持續(xù)下降至 1.16%。
綜上所述，普氏菌屬（Prevotella_9）、擬桿菌屬（Bacteroides）、布勞特氏菌（Blautia）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、丁酸弧菌屬（Anaerostipes）為健康人腸道內(nèi)普遍存在的菌群屬，在口服益生菌片劑期間都有所增加，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬和鏈球菌屬為腸道有益菌在干預(yù)時(shí)期有所增加，乳桿菌屬持續(xù)減少。
（4）群落 Heatmap 圖。
Heatmap 圖是以顏色梯度來(lái)表征二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)大小，并呈現(xiàn)群落物種組成信息。一般基于物種或樣本間豐度的相似性進(jìn)行聚類分析，并將結(jié)果展現(xiàn)在群落 heatmap 圖上，這使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，分類明顯，不同分組（或樣本）在各分類水平上的群落組成的相似性和差異性可以通過(guò)相似程度與顏色變化來(lái)反映。群落 Heatmap 圖，熱圖下側(cè)和右側(cè)分別為樣本名稱和 OTU 編號(hào)（或者物種名稱），如果進(jìn)行了聚類分析左側(cè)和上側(cè)分別為物種聚類樹(shù)和樣本聚類樹(shù)。熱圖中顏色的深淺分別代表 OTU（或者物種）豐度的高低。
Heatmap 圖是以顏色梯度來(lái)呈現(xiàn)菌群中的物種組成信息，顏色的變化和相似程度體現(xiàn)了不同樣品中菌群組成的差異性和相似性。通過(guò) Bar 圖分析了服用益生菌片劑不同時(shí)期組血液透析患者腸道菌群的組成（見(jiàn)圖 3-6），接著利用群落 Heatmap圖（見(jiàn)圖 3-7）來(lái)觀察三個(gè)不同時(shí)期 20 名血透患者菌群結(jié)構(gòu)的變化和差異性，并在科分類水平上運(yùn)用 Students ’ T 檢驗(yàn)分析不同處理組間的差異物種，Heatmap圖中，基線 V0 到干預(yù) V6 紅色快和綠色快大部分呈緩慢變化趨勢(shì)，也有變化較大的色塊，尤其是以 Phyllobacteriaceae（ P=8.007E-09<0.01）、Alcaligenaceae（P=0.04384<0.05）為代表（見(jiàn)圖3-4A）。干預(yù)V2期中紅色色塊代表Bacteroidaceae、Nocardiaceae、Verrucomicrobiaceae、Fusobacteriaceae、Prevotellaceae 色塊顏色加深 ， 相 對(duì) 豐 度 上 升 ， 占 比 提 高 ， 綠 色 色 塊 代 表 Family_XIII 、norank_o__Mollicutes_RF9、Bacteroidales_S24-7_group 色塊顏色加深，相對(duì)豐度下降， 占比減少。干預(yù) V6 組中以為 Bifidobacteriaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Verrucomicrobiaceae、Fusobacteriaceae、Enterococcaceae 代表的紅色色塊顏色加深，相對(duì)豐度上升， 占比提高。
Heatmap 圖通過(guò)顏色梯度變化直觀地顯示了服用益生菌片劑不同時(shí)期組血液透析患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，干預(yù) V2 組的色塊顏色和干預(yù) V6 組都有所變化，說(shuō)明口服益生菌片劑兩個(gè)月促進(jìn)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。從圖 3-4B 可以看出，與基線 V0 組的 20 名血透患者腸道菌群相比，口服益生菌片劑六個(gè)月后，血透患者腸道中 Phyllobacteriaceae（P=8.007E-09<0.01）相對(duì)豐度顯著下降，腸球菌屬Enterococcus 比例下降（2.0%下降至 1.2%），未分類擬桿菌 Bacteroidales_S24-7（P=0.04<0.05）比例顯著降低，擬普雷沃菌 Alloprevotella 比例下降（P=0.054），葡萄球菌 Staphylococcus 比例下降（2.16%下降至 0.03%）。
3.3.3.4 樣本比較分析。
（1）PLS-DA 分析。
PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)，即偏最小二乘法判別分析，是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法，經(jīng)常用來(lái)處理分類和判別問(wèn)題。通過(guò)對(duì)主成分適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)，PLS-DA 可以有效的對(duì)組間觀察值進(jìn)行區(qū)分，并且能夠找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量。
利用 Alpha 多樣性分析初步證明了以口服益生菌片劑服用時(shí)期不同為分組對(duì)菌群多樣性無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，本實(shí)驗(yàn)接著進(jìn)行樣本分組分析，利用基于 OTU 水平下的PLS-DA 分析來(lái)比較口服益生菌片劑的不同時(shí)期為分組，對(duì)篩選的 20 名血液透析便秘患者的腸道微生物群落組成的差異進(jìn)行分析。如圖所示：樣本分組分析通過(guò)比較樣品間進(jìn)化信息的差異得到距離矩陣，直觀顯示不同樣品中微生物群落在進(jìn)化上的差異性。基于 OTU 水平下的 PLS-DA 分析在特定的進(jìn)化譜系中挖掘影響環(huán)境樣品菌落組成差異的潛在主成分，PLS-DA 圖，樣本點(diǎn)的空間距離代表樣本間的距離。
如圖 3-8 所示，PLS-DA 分析比較了未服用益生菌片劑 V0 期和服用益生菌片劑兩個(gè)月 V2 期和服用益生菌片劑六個(gè)月 V6 期血液透析患者腸道菌群組成的差異。COMP1（3.71%）和 COMP2（4.61%）是總變異中權(quán)重最高的兩個(gè)主成分，散點(diǎn)的分布顯示樣本發(fā)生不明顯的區(qū)分，與未服用益生菌片劑 V0 期相比，服用益生菌片劑兩個(gè)月 V2 期和服用益生菌片劑六個(gè)月 V6 期血液透析患者菌群結(jié)構(gòu)差異較小，都集中在 COMP1 軸中側(cè)偏左處。此外，在 COMP2 軸上，服用益生菌片劑兩個(gè)月 V2 期和服用益生菌片劑六個(gè)月 V6 期樣品左右分布，說(shuō)明口服益生菌片劑對(duì)腸道菌群起到了調(diào)節(jié)作用不明顯，而兩組樣本的點(diǎn)有個(gè)別交互的現(xiàn)象，可能是由于選擇人群的個(gè)體有較大差異的情況下對(duì)腸道菌群的影響具有局限性，所以服用益生菌片劑的兩個(gè)時(shí)期的菌群結(jié)構(gòu)存在一定的共性。結(jié)果表明口服益生菌片劑調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)效果不明顯。
3.3.3.5 物種差異分析。
物種差異分析根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用相關(guān)的分析方法進(jìn)行分析，檢測(cè)不同組（或樣本）微生物群落表現(xiàn)出的豐度差異。 物種差異性分析模塊的內(nèi)容包括：組間差異顯著性檢驗(yàn)、Lefse 多級(jí)物種差異判別分析。
組間顯著性差異檢驗(yàn)根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)不同組（或樣本）微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平，獲得組（或樣本）間顯著性差異物種。該分析可在不同分類學(xué)水平下進(jìn)行。
（1）多組比較。
多組樣本指大于 2 組以上樣本之間物種的差異比較一般采用以下方法：
① one-way ANOVA，又稱單因素方差分析，可用于檢驗(yàn)多組樣本的均值是否相同。通過(guò)此分析可以比較物種在 3 組或 3 組以上樣本組中的分布是否存在顯著性差異，同時(shí)對(duì)有差異的特征進(jìn)行 post-hoc 檢驗(yàn)多組中存在差異的樣本組。
② Kruskal_Wallis 秩和檢驗(yàn)，簡(jiǎn)稱克氏秩和檢驗(yàn)，它是一個(gè)將兩個(gè)獨(dú)立樣本的 wilcox 秩和檢驗(yàn)推廣到 3 個(gè)或更多組檢驗(yàn)的方法。是多組（大于等于 3）獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的一種方法。該分析可以對(duì)多組樣本的物種進(jìn)行顯著性差異分析，并對(duì) P 值計(jì)算假發(fā)現(xiàn)率 q 值，單物種比較柱形圖，縱坐標(biāo)表示不同分類水平下的物種名，橫坐標(biāo)表示該樣本的某一物種豐度的百分?jǐn)?shù)數(shù)值，不同顏色表示不同分組。
如圖 3-9 所示，在屬水平下進(jìn)行基線 V0 期與干預(yù) V2、V6 期的三組的腸道菌群群落進(jìn)行比較分析。布勞特氏菌屬(Blautia)、Faecalibacterium、胃瘤球菌屬([Ruminococcus]_torques_group)干預(yù) V2 期增加，三組比較呈減少趨勢(shì)；普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)在干預(yù) V2 期增加，且三組比較有所增加；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)干預(yù) V2 期減少，干預(yù) V6 期增加，三組比較呈增加趨勢(shì)；Anaerostipes 、 直 腸 真 桿 菌 屬 ([Eubacterium]_rectale_group) 、 霍 氏 真 桿菌 屬([Eubacterium]_hallii_group) 、 埃 希 菌 屬 (Escherichia-Shigella) 、 紡 錘 鏈 桿 屬(Fusicateibacter)三組比較呈逐漸減少趨勢(shì)；鏈球菌屬(Streptococcus)干預(yù) V2 期增加，干預(yù) V2 到干預(yù) V6 期減少，三組比較無(wú)變化；Ruminococcus_2 干預(yù) V2 期減少，干預(yù) V6 期無(wú)變化，總體減少；Subdoligranulum 干預(yù) V2 期減少，干預(yù) V6 期增加，總體減少；Enterococcus 干預(yù) V2 期無(wú)變化，干預(yù) V2 到干預(yù) V6 期增加，總體 增 加 。 可以 表 明口 服 益 生菌 片 劑 第二 個(gè) 月布 勞 特 氏菌 屬 (Blautia) 、Faecallbacterum 、 胃 瘤 球 菌 屬 ([Ruminococcus]_torques_group) 、 擬 桿 菌 屬(Bacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella_9)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)增加，第六個(gè)月有所維持或減少，干預(yù) V2 期和干預(yù) V6 期相比有效果，但三組腸道菌群比較均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明益生菌片劑對(duì)干預(yù) V6 期血液透析患者腸道菌群的調(diào)節(jié)作用不明顯，導(dǎo)致三組比較無(wú)顯著差異菌。
（2） 兩組比較。
選擇的兩組樣本之間物種的差異比較一般采用以下 3 種方法：
T 檢驗(yàn)，又稱 Student’s t-test(equal variance)、 Welch T 檢驗(yàn) (方差不等)，又稱 Welch’s t-test(unknow variance)和 wilcox 秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon rank-sum test），也叫曼-惠特尼 U 檢驗(yàn)（Mann–Whitney U test），這些分析可以對(duì)兩組樣品的物種進(jìn)行顯著性差異分析，并對(duì) p 值進(jìn)行多種方法的校正,多物種差異檢驗(yàn)柱形圖，縱坐標(biāo)表示不同分類水平下的物種名，橫坐標(biāo)表示該樣本的某一物種豐度的百分?jǐn)?shù)數(shù)值，不同顏色表示不同分組。0.01<p<=0.05 *="" 0.001<="" p="" <="0.01" **=""p<="0.001" ***<="">。
如圖 3-10-1 所示，基線 V0 期和干預(yù) V2 期在目水平下的菌群群落顯示，擬桿菌目（Bacteroidales（）P<0.05）具有顯著性差異.，干預(yù) V2期擬桿菌目（Bacteroidales）水平顯著提高。如圖 3-10-2 所示，基線 V2 期和干預(yù) V6 期在綱水平下的菌群群落顯示，變形菌目（Alphaproteobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異。如圖 3-10-3所示，基線 V0 期和干預(yù) V6 期在綱水平下的菌群群落顯示，β-變形菌（Betaproteobacteria）(P<0.05)具有顯著性差異，藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異差異，變形菌（Alphaproteobacteria）（P<0.01）具有極大顯著性差異。
3.3.3.6 關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測(cè)分析。
?。?）環(huán)境因子相關(guān)性 Heatmap 圖。
采用監(jiān)督式多元分析方法，引入樣本環(huán)境因子信息與群落豐度進(jìn)行分析，研究環(huán)境因子與物種、樣本之間的相互影響的關(guān)聯(lián)關(guān)系?？梢杂脽釄D直觀的展現(xiàn)數(shù)值矩陣,相關(guān)性熱圖，熱圖的 X 軸和 Y 軸分別為環(huán)境因子和物種（或 OTU），通過(guò)計(jì)算獲得 R 值和 P 值。R 值在圖中以不同顏色展示，熱圖右側(cè)色卡是不同 R 值的顏色分區(qū)。0.01<p<=0.05 *="" 0.001<="" p="" <="0.01" **="" p<="0.001"***<=""> 。
如圖 3-11 所示，藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobaceria）和透析時(shí)間（time）呈顯著負(fù)相關(guān)；疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）與水分含量(MC)和乙酸含量（Acetic）呈顯著負(fù)相關(guān)，與 pH、腎病類型（type）和異戊酸含量（Isovaleric）呈顯著正相關(guān)；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）與尿酸（UA）呈顯著負(fù)相關(guān)，與 pH 呈顯著正相關(guān)；unclassified_k_norank、黏膠球形菌門(mén)（Lentisphaere）與透析時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)；互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）與尿素（UREA）和 pH 均呈顯著正相關(guān)；柔膜菌門(mén)（Tenericutes）與透析時(shí)間（time）、乙酸含量（Acetic）和丙酸含量（Propionic）均呈顯著負(fù)相關(guān)；變形菌門(mén)（Proteobacteria）與丁酸含量(Butyric)呈顯著負(fù)相關(guān)，與腎病類型（type）呈顯著正相關(guān);梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）與透析時(shí)間（time）呈顯著正相關(guān);放線菌門(mén)（Actinobacteria）與異丁酸含量（Isobutyric）呈顯著負(fù)相關(guān)；另外 WS6、Saccharibacteria、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）與透析時(shí)間（time）、水分含量(MC)、丁酸含量(Butyric)、乙酸含量（Acetic）、丙酸含量（Propionic）、尿素（UREA）、肌酐、尿酸（UA）、pH、腎病類型（type）、年齡、異丁酸含量（Isobutyric）和異戊酸含量（Isovaleric）均無(wú)明顯相關(guān)性。
（2）Random Forest 分析。
隨機(jī)森林（Random Forest）屬于機(jī)器學(xué)習(xí)算法，是一個(gè)包含多棵決策樹(shù)的分類器，它的分類結(jié)果根據(jù)檢測(cè)樣本的各個(gè)維度上的屬性，在不同的決策樹(shù)上進(jìn)行判定，綜合考慮所有判定結(jié)果后給出最終分類，對(duì)于分類問(wèn)題結(jié)果取概率最大值，回歸分析則取概率均值，它可以高效快速挑選出對(duì)樣本分類最為重要的物種類別（biomarker）。
采用隨機(jī)森林方法進(jìn)行的 ROC 分析，通過(guò)從預(yù)測(cè)集去除 OTU 引起誤差的增加的多少給每一個(gè) OTUs 評(píng)估一個(gè)重要性的得分，根據(jù)表 3-4 共得到了 5 個(gè)OTUs，其相對(duì)豐度能夠可靠的鑒別口服益生菌 V6 期與基線 V0 期對(duì)照的樣本。這些有差異的 OTUs 主要集中在變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。
3.3.4 益生菌和腸道菌群相關(guān)性分析。
在門(mén)的水平上，近些年國(guó)內(nèi)外進(jìn)任的一系列人口調(diào)查實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)人體腸道菌群主要由硬壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)構(gòu)成，隸屬于上述四個(gè)菌門(mén)的細(xì)菌占到了人體細(xì)菌總量的 99%上雖然在口的水平上各個(gè)國(guó)家地區(qū)的人群都主要由上述四個(gè)菌口構(gòu)成，但具體到屬的水平上如前言部分所述，不同時(shí)期的人們腸道菌群結(jié)構(gòu)便開(kāi)始出現(xiàn)較大的個(gè)體差異性，這說(shuō)明人體腸道菌群的組成是極為復(fù)雜的、在很大程度上也是受外界環(huán)境影響的。
益生菌對(duì)腸道菌群的影響是多方面的，根據(jù)其對(duì)腸道菌群影響的機(jī)制不同，可將這種影響分為直接影響和間接影響。直接影響是指人體食用酸奶或菌片等富含益生菌的產(chǎn)品以后，益生菌能直接影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)。間接影響是指攝入益生茜以后，益生菌會(huì)對(duì)腸道菌群的代謝如短鏈脂肪酸的代謝和總膽汁酸代謝，腸道細(xì)菌酶活力，腸道內(nèi)礦物質(zhì)的吸收等產(chǎn)生影響。益生菌的攝入對(duì)體內(nèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。大量研巧表明，通過(guò)口服益生菌的方式可快速改變宿主腸道菌群的結(jié)構(gòu)。這可能是由于人們?cè)跀z入富含益生菌的產(chǎn)品后，大量活性益生菌被直接送到人體腸道中，從而使腸道菌群的構(gòu)成在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了較大的變化。除此之外，益生菌進(jìn)入腸道后會(huì)通過(guò)代謝作用，殺滅一部分致病茜、并促進(jìn)部分有益菌的生長(zhǎng)，這也會(huì)在一定程度上改變宿主腸道菌群的構(gòu)成[76][92–95。
3.3.5 腸道菌群和短鏈脂肪酸相關(guān)性分析。
如圖 3-3—圖 3-11，表 3-3 和表 3-4 所示，腸道是人體最重要的新陳代謝器官，腸道菌群直接的影響到人體的新陳代謝。腸道菌群最主要的功能就是通過(guò)發(fā)酵碳水化合物實(shí)現(xiàn)能量的廢物利用，例如發(fā)酵難消化的食物殘羹（植物細(xì)胞壁，纖維素和低聚糖），粘蛋白側(cè)鏈和脫落的上皮細(xì)胞。除了能量的廢物利用，腸道微生物還利用產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，發(fā)酵產(chǎn)生氣體（氫氣、二氧化碳和甲燒）和生物量，這些都直接影響腸道的生理機(jī)能。腸道微生物的成分也用來(lái)合成某些族和族的維生素并能影響上皮細(xì)胞的表達(dá)，此外，它們還通過(guò)代謝外源物質(zhì)來(lái)保持氦基酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并影響藥物的功效，這些都大大增強(qiáng)了宿主防御外源物質(zhì)的能力。
其中，腸道微生物在人體結(jié)腸中通過(guò)發(fā)酵食物產(chǎn)生了人體所必須的短鏈脂肪酸主要有三種脂肪酸：乙酸、丙酸、丁酸。脂肪酸給細(xì)胞提供能量（乙酸供給肌肉，丙酸供給肝臟，丁酸供給結(jié)腸細(xì)胞），影響結(jié)腸代謝，控制上皮細(xì)胞的增值和變異。被鑒定為具有短鏈脂肪酸產(chǎn)生功能的勞特氏菌屬（Blautia）、梭菌屬（Clostridium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和罕見(jiàn)小球菌屬（Subdoligranulum），棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）。在腸道中主要的代謝產(chǎn)物為短鏈脂肪酸的菌屬及其代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的種類參見(jiàn)表 3-5：
3.4 本章小結(jié)。
益生菌干預(yù)便秘改善，從糞便短鏈脂肪酸的測(cè)定和 16s 高通量菌群測(cè)序結(jié)果分析來(lái)看，研究結(jié)果表明 V0 和 V2 期的乙酸含量、丙酸含量有顯著性差異（P<0.05），V2 期和 V6 期的丁酸含量有顯著性差異（P<0.05），其它均無(wú)顯著性差異；腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，厚壁菌門(mén)持續(xù)減少，厚壁菌門(mén)大部分是專性厭氧菌，維持腸道正常的營(yíng)養(yǎng)、代謝及免疫功能，而擬桿菌門(mén)增加，以往研究發(fā)現(xiàn)，血液透析會(huì)改變厚壁菌門(mén)的生存環(huán)境，利于擬桿菌門(mén)細(xì)菌生存和繁殖。干預(yù) V2 期的雙歧桿菌屬 Bifidobacterium 下降到 3.82%。乳桿菌屬豐度下降，鏈球菌屬（Streptococcus）是上升至 3.72%，巨單胞菌屬（Megamonas,0%）下降，羅斯氏菌屬（Roseburia,1.17%）增加。到干預(yù) V6 期雙歧桿菌屬 Bifidobacterium 增長(zhǎng)到6.98%，腸球菌屬（Enterococcus）上升至 6.59%，鏈球菌屬（Streptococcus）持續(xù)上升至 2.43%，乳桿菌屬（Lactobacillus）持續(xù)下降到 0.51%，巨單胞菌屬（Megamonas,1.02%）增加，羅斯氏菌屬（Roseburia,0.43%）減少。雙歧桿菌屬和腸球菌屬豐度在干預(yù)六個(gè)月增加較多，而其他腸道有益菌無(wú)較大改變。在干預(yù)期間變形菌門(mén)豐度上升，腸道內(nèi)有害菌增加不明顯，導(dǎo)致腸屏障功能受損。而藍(lán)細(xì)菌、互養(yǎng)菌門(mén)、黏膠球形菌門(mén)對(duì)健康和疾病的影響未知，需要進(jìn)一步研究明確。
口服益生菌片劑六個(gè)月對(duì)腸道菌群改善來(lái)看，腸道內(nèi)的有益菌增多但有害菌或腸道其他環(huán)境并無(wú)較大抑制作用。
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