1.RT-PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-qPCR區(qū)分
RT-PCR指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR），在RT-PCR中，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增；qPCR和Real-timePCR均指實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-Time PCR），相較于常規(guī)PCR，qPCR能夠在每個(gè)循環(huán)周期內(nèi)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，從而對(duì)起始模板數(shù)量進(jìn)行精確的分析，具有高敏感度和特異性；RT-qPCR指的是實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription- quantitative PCR），是qPCR RT-PCR的組合，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再作為模板進(jìn)行qPCR定量分析。
2. SYBRGreen I染料法
SYBR Green I染料：一種可以在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料；原理：通過(guò)SYBR Green I染料與PCR過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合，而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；過(guò)程：（1）在PCR過(guò)程中，DNA聚合酶可對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即“擴(kuò)增子”；（2）SYBRGreen I染料與每一個(gè)新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進(jìn)行結(jié)合；（3）隨著PCR的進(jìn)擴(kuò)增，越來(lái)越多的擴(kuò)增子生成，由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，因此熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加；（如下圖所示）優(yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，可用于監(jiān)測(cè)任何雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，運(yùn)行成本低；缺點(diǎn)：SYBR Green I染料可能與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。除此之外，需要不斷的優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增。
圖片源自：https://www.smobio.com/faq-real-time-pcr
3. Taqman探針?lè)?div style="height:15px;">
原理：通過(guò)熒光探針在PCR循環(huán)過(guò)程中隨PCR產(chǎn)物的累積而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
過(guò)程：（如上圖所示）
(1) 構(gòu)建Oligo探針：5’端標(biāo)記熒光染料報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)的靠近會(huì)通過(guò)空間上的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光；
(2) 如果存在目標(biāo)序列，探針便會(huì)在其中一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過(guò)Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除；
(3) 探針的切除將報(bào)告染料基團(tuán)和淬滅染料基團(tuán)進(jìn)行分離，增強(qiáng)了報(bào)告染料基團(tuán)的信號(hào)。并且可以將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸；
(4) 每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，就會(huì)有更多的報(bào)告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著合成的擴(kuò)增片段數(shù)量的增加而增加；
優(yōu)點(diǎn)：（相較于SYBR Green I染料法）
(1) 高特異性和靈敏性：熒光探針只與目的序列結(jié)合，不受非特異性產(chǎn)物的影響；
(2) 兼容多重反應(yīng)：由于不同波長(zhǎng)的熒光報(bào)告基團(tuán)可以標(biāo)記不同的探針，因此可以選擇不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增并檢測(cè)不同的序列；
(3) 節(jié)省時(shí)間和原料成本：無(wú)需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本；
缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。
4. 絕對(duì)定量（Absolute Quantification）
原理：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行的定量。
舉例：可以通過(guò)qPCR計(jì)算出待測(cè)樣本的初始拷貝數(shù)，如1ml血液里有多少個(gè)HBV病毒。可根據(jù)病毒的拷貝數(shù)，監(jiān)控疾病狀態(tài)。
5. 相對(duì)定量（Relative Quantification）
原理：用于分析特定樣品相對(duì)于參照樣品某個(gè)基因表達(dá)量的變化。
舉例：用于檢測(cè)藥物引起的基因表達(dá)改變，將經(jīng)藥物處理樣品的特定目標(biāo)基因的表達(dá)水平相對(duì)未處理樣品的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。
結(jié)果分析相關(guān)術(shù)語(yǔ)
6. 擴(kuò)增子（Amplicon）PCR過(guò)程擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA短片段。7. 擴(kuò)增曲線（Amplification Plot）PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光信號(hào)為縱坐標(biāo)制作的曲線。（如下圖所示）擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。8. 基線（Baseline）PCR起始時(shí)，熒光信號(hào)還未發(fā)生變化的幾個(gè)循環(huán)。9. 本底信號(hào)即樣本的熒光背景值，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋。一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，可通過(guò)算法去除。10.熒光閾值（Threshold）熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，通常儀器會(huì)自動(dòng)設(shè)置。如果手動(dòng)設(shè)置，原則要大于樣本的熒光背景值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段。11.循環(huán)閾值（CycleThreshold, Ct值）Ct值是指在熒光 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板的拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)就越少，Ct 值也就越小。12.惰性參比染料（ROX）用作熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照，可以逐孔校正因移液不準(zhǔn)確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。通常，不同儀器有不同ROX需求，目前國(guó)產(chǎn)儀器基本無(wú)需ROX校準(zhǔn)要求。13.均一化報(bào)告基團(tuán)（Rn）熒光染料報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R）釋放的熒光強(qiáng)度除以惰性參比染料的熒光強(qiáng)度。14. ΔRn在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號(hào)量級(jí)。ΔRn=(Rn )– (Rn-)，Rn : 一次反應(yīng)的Rn值，Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。
15.熔解曲線（Meltingcurve）qPCR擴(kuò)增完成后，對(duì)PCR產(chǎn)物加熱，隨溫度升高，DNA逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，當(dāng)?shù)竭_(dá)某一溫度時(shí)（Tm），會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。熔解曲線分析可以用來(lái)確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，對(duì)PCR的特異性進(jìn)行鑒定。（如下左圖所示）16.熔解溫度（Tm）DNA雙鏈解鏈一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。G-C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。17.對(duì)數(shù)曲線（logarithmcurve）對(duì)熔解曲線取對(duì)數(shù)，形成峰圖，更直觀的顯示PCR產(chǎn)物片段的情況。通常根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在80-300 bp范圍內(nèi)，熔解溫度在80℃-90℃之間。（如下右圖）
絕對(duì)定量相關(guān)術(shù)語(yǔ)
18.標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度樣品，為保證標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定，通常將基因片段克隆到質(zhì)粒后，作為標(biāo)準(zhǔn)品。19.標(biāo)準(zhǔn)曲線（StandardCurve）將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋（通常為5-6個(gè)稀釋梯度），將未知樣品和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一qPCR實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)擴(kuò)增曲線，以稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為橫坐標(biāo)，起始拷貝數(shù)的log值為縱坐標(biāo)構(gòu)建。（如下圖所示）理論上，稀釋樣品的擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距，如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距（兩個(gè)樣本Ct值差）符合等式“2n＝稀釋倍數(shù)”，如：10倍稀釋的樣本，2n＝10，n=3.32，即Ct值差為3.32。20.擴(kuò)增效率（Amplificationefficiency）擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相關(guān)，斜率的絕對(duì)值與熒光曲線間距相同，擴(kuò)增效率計(jì)算式為E＝10-1/斜率，如果將擴(kuò)增效率用百分率來(lái)表示，則E%=(E-1)×100%。一般說(shuō)來(lái)，擴(kuò)增效率接近 100%是重復(fù)性好的標(biāo)志，然而在實(shí)際操作時(shí)，擴(kuò)增效率應(yīng)該在90%-105%之間，如果擴(kuò)增效率低，可能的原因是引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；若擴(kuò)增效率大于100%，可能由于稀釋樣品加樣錯(cuò)誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體產(chǎn)生。
相對(duì)定量相關(guān)術(shù)語(yǔ)
21.內(nèi)參（Internalreference）在同一反應(yīng)中作為靶序列擴(kuò)增，并用不同的探針進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)的對(duì)照序列。22.內(nèi)參基因（Referencegene）內(nèi)源性參比基因的表達(dá)水平在樣品間不存在差異，如管家基因（Housekeepinggenes, HKGs），常用GAPDH、β-actin 、18SrRNA和28S rRNA等。23.標(biāo)準(zhǔn)樣品（StandardSample）相對(duì)定量中使用的參比樣品，用與其他樣品進(jìn)行比較，確定某一基因的相對(duì)表達(dá)水平。24.陽(yáng)性對(duì)照（PositiveControl）用已知量模板作對(duì)照，通常用來(lái)檢查引物工作是否正常，以及反應(yīng)程序是否正確設(shè)置。25.陰性對(duì)照（NegativeControl）重要的陰性對(duì)照包括無(wú)模板對(duì)照（No template control，NTC）和無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照（No reverse transcriptasecontrol，NRC）。NTC：包含除模板之外的所有擴(kuò)增反應(yīng)所必要組分的對(duì)照反應(yīng)，模板通常用水代替，用于檢測(cè)試劑污染或外源DNA造成的污染；NRC：在反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候多配制一個(gè)體系，不加反轉(zhuǎn)錄酶，其余成分正常添加，在相同的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程下獲得的產(chǎn)物，以此為模板，觀察擴(kuò)增情況，用于檢驗(yàn)cDNA中是否有基因組DNA的污染。
百力格探針引物合成
百力格生物致力于提供高質(zhì)量工業(yè)級(jí)探針引物合成服務(wù)，可以實(shí)現(xiàn)單批次2 OD-8000 OD大規(guī)格的高純度、高精度、防污染探針與引物的合成與純化，充分滿足客戶對(duì)于穩(wěn)定性、可靠性的需求。
qPCR探針類型
類型
詳情
單標(biāo)熒光探針FAM、VIC、HEX、TET、ROX、JOE、Cy3、CY5、TAMRA、Texas Red等
雙標(biāo)熒光探針
熒光基團(tuán)：FAM、VIC、HEX、ROX、Cy3、Cy5、NED等
淬滅基團(tuán)：MGB、BHQ、TAMARA系列等
特殊單標(biāo)熒光探針地高辛Dig、磷酸Phosphorylation、生物素Biotin等
修飾硫代修飾、氨基修飾、巰基修飾、稀有堿基等
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