食品微生物檢測
第一部分、微生物知識
什么是微生物?
定義:一大類個體微小、結構簡單、形態(tài)多樣,需借助顯微鏡才能看見的微小生物類群的總稱。
微生物通常包括病毒、細菌、真菌、原生動物和某些藻類。
微生物種類：
★細菌:肺炎球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌；
★真菌:霉菌、酵母菌、念珠菌（濕疹)；
★放線菌:從放線菌中發(fā)現(xiàn)鏈霉素、土霉素；
★支原體:肺炎支原體；
★衣原體:沙眼；
★立克次體:斑疹傷寒；
★螺旋體:梅毒；
★病毒:甲、乙肝病毒，麻疹病毒，流感病毒。
細菌:是一類細胞細而短、直徑一般為0.5~5.0um,結構簡單、細胞壁堅韌,以二分裂方式無性繁殖的原核微生物，分布廣泛。生長最適溫度為30~35℃，主要去除方法有紫外殺菌法、濾膜過濾法及高溫殺滅法等。
個別細菌如:嗜熱脂肪芽孢桿菌，能在121℃條件，可耐受4~5min。
真菌:包括單細胞與多細胞兩類，單細胞真菌呈圓形或卵圓形稱為酵母菌;多細胞真菌由菌絲和孢子組成，稱為絲狀菌或霉菌。
真菌生長的最適的溫度為23～28℃，一般加熱60~70℃1小時即被殺死,用一定濃度的酒精及甲醛也可殺死。
病毒:屬非細胞型微生物,在自然界分布非常廣泛，可在人、動物、植物、真菌和細菌中寄居并引起感染。病毒是體積最小、結構最簡單的微生物，它僅有一種核酸(DNA或RNA）作其遺傳物質。
微生物五大共性
體積小、面積大:個體極其微小，必須借助顯微鏡放大幾倍、幾百倍、上千倍，乃至數(shù)萬倍才能看清。
吸收多、轉化快：食譜廣泛,凡是動植物能利用的營養(yǎng),微生物都能利用,大量的動植物不能利用的物質,甚至劇毒的物質,微生物照樣可以視為美味佳肴。
生長旺、繁殖快：二分裂是細菌最普遍、最主要的繁殖方式。
適應強、變異頻：能耐0~-196℃的低溫,可在250~300℃的高溫條件下正常生長。
分布廣、種類多：微生物幾乎無處不有,無孔不入,地球上有200萬生物,其中微生物有20萬種之多。
微生物在自然界的分布:
?土壤:是微生物生活的最適環(huán)境，土壤中的微生物又可分為如下幾類:
細菌:占土壤微生物總數(shù)的70%~90%。
放線菌:占土壤中微生物含量的5%~30%。
霉菌:主要生活在靠近地面的土壤中，在通氣良好的土壤中，霉菌數(shù)量很多。
酵母菌:普通土壤中酵母菌含量很少。
?水:僅次于土壤的微生物分布、定居的第二場所，90%為革蘭氏陰性菌，主要有假單胞菌、黃桿菌等。
?空氣:空氣中的微生物主要來源于帶有微生物菌體及孢子的灰塵(這類微生物大多數(shù)是腐生性的，)還來源于人和動物，它們大多數(shù)是通過呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，懸浮在大氣中。
微生物在人體中的分布:
?在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種腔道(如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道)等部位，存在著對人體無害的微生物群。
部位
常見菌種
皮膚
表皮葡萄球菌、類白喉桿菌、綠膿桿菌、恥垢桿菌等
口腔
鏈球菌（甲型或乙型>、乳酸桿菌、螺旋體、梭形桿菌、白色念球菌、(真菌)表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、類白喉桿菌
胃
正常一般無菌
腸道
類桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、厭氧性鏈球菌、糞鏈球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸桿菌、變形桿菌、破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等
鼻腔
甲型鏈球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感桿菌、乙型鏈球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等
眼結膜
皮表葡萄球菌、結膜干燥桿菌、類白喉桿菌等
實驗室中微生物的生長基質
★培養(yǎng)基:人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合體。
培養(yǎng)基中主要包含了微生物生長所需要的碳源、氮源、無機鹽及微量元素。
影響微生物生長繁殖的因素：營養(yǎng)、溫度、滲透壓、pH、水份、氧氣、光照等。
消毒、滅菌概念
（1）滅菌 滅菌是采用強烈的理化因素殺死物體表面及內部的所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）繁殖體及芽孢的過程。滅菌后的物體不再有任何可存活的微生物營養(yǎng)體及其芽孢、孢子，即處于無菌狀態(tài)，否則就是滅菌不徹底。
（2）消毒 消毒是用較為溫和的理化因素僅殺死物體表面或內部一部分對人或動、植物有害的病原微生物，而對被消毒的對象基本無害的措施。一般消毒劑在常用濃度下只對細菌的營養(yǎng)體有效，對細菌的芽孢則無殺滅作用。
（3）防腐 食品防腐劑是能防止由微生物引起的腐敗變質、延長食品保質期的添加劑。因兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用，又稱抗微生物劑（antimicrobial）。它的主要作用是抑制食品中微生物的繁殖。
消毒和滅菌前提條件:清洗干凈!
熱力滅菌：
滅菌（消毒）類型
溫度與時間
殺菌范圍
滅菌物品
干熱滅菌
火焰滅菌
火焰灼燒
全部微生物
耐熱物品、接種環(huán)、試管口等
熱空氣滅菌
160℃ 2h
玻璃器皿、金屬用具、等耐熱物品
濕熱滅菌
高壓蒸汽滅菌法
121℃ 15-30min
培養(yǎng)基、生理鹽水、玻璃器皿等
115℃ 15-20min
濕熱滅菌比干熱效果好：
1.水蒸汽穿透力強；
2.菌體蛋白質吸收水分易凝固；
3.蒸汽凝結成水，放出潛熱，提高物體溫度；
化學消毒：
類別
名稱
常用濃度
應用范圍
作用機理
醇類
乙醇
70~75%
皮膚、體溫計、器械消毒
脫水、蛋白質變性
表面活性劑
新潔爾滅
0.05~1%
皮膚、器械消毒
破壞細胞質、改變通透性
酸類
乳酸
0.33~1mol/L
空氣消毒
氧化劑
過氧乙酸
0.2~0.5%(須嚴格控制濃度)
塑料、玻璃、紡織原料及人造纖維制品:也適用于食品表面消毒(水果、蔬菜、雖類)和環(huán)境地面消毒
與蛋白質活性基團反應，酶失活
氯制劑
漂白粉(次氨酸鈣)
0.5~1.2%
飲用水、廠房和用具,
澄清溶液可用水果和蔬菜消毒
殺死細菌芽孢
鹵素
氯氣
0.2~1ppm
飲用水消毒
殺死細菌芽孢
酚類
來蘇爾
1~2%
手、皮膚消毒
殺死細菌芽孢
3-5%
器械、地面消毒
第二部分環(huán)境控制要求
●為什么要對食品生產(chǎn)進行微生物控制?
微生物是食品加工中最主要的危害之一，其中尤以致病菌為甚。致病菌污染食物或食品微生物超標會造成食品的腐敗、變質。而人們食用被污染、腐敗、變質的食物后，會出現(xiàn)發(fā)燒、腹瀉、中毒等癥狀，更有甚者會危及生命。
●主要的微生物污染源
人員、設備、原輔料、法、環(huán)
●人員與微生物
人員是潔凈室中的最大污染源。
人在代謝過程中會釋放和分泌污染物，人體表面、衣服能沾染、攜帶污染物，在潔凈室內的各種動作也會產(chǎn)生微粒和微生物。GMP對人員有著嚴格的要求。
人體不同部位所帶細菌數(shù)量
部位
細菌數(shù)(CFU)
手部
100~-1000/cm2
前額
1000~-100000/cm2
頭皮
約100萬/cm2
鼻腔分泌物
約1000萬/g
唾液
約10億/g
★防范措施:
1.建立個人健康檔案
新員工入廠全面體檢，直接接觸食品的生產(chǎn)人員每年至少體檢一次，如發(fā)現(xiàn)有傳染疾病應立即隔離。
2.清潔的個人衛(wèi)生
①勤洗澡、理發(fā)、剪指甲；
②正確的洗手、更衣流程及防護方式；
3.潔凈區(qū)內的自我約束
①不佩帶首飾，不化妝；
②進出次數(shù)應可能地少，在操作過程中應減小動作幅度；
③規(guī)范各類操作及避免違規(guī)行為；
人員進入潔凈區(qū)的程序
一次更鞋:阻斷外界粘在鞋底的垃圾、顆粒及微生物。相對而言,腳底是最臟的部分。
脫去外套:阻斷外界沉降在外套上的顆粒和微生物。
一更洗手:規(guī)范的洗手能消除手部皮膚的污垢和大部分的微生物。洗手一定要用洗手液和充足的流水。
二更
帶口罩:阻斷鼻腔、呼吸道的微生物發(fā)散，潔凈區(qū)內不能脫下口罩。
帶發(fā)套:阻斷頭發(fā)、頭皮表面的微生物發(fā)散。保證發(fā)套完整的包裹頭發(fā)。穿連體服:阻斷體表皮膚的微生物發(fā)散。潔凈區(qū)內不能解開連體服。
手消毒:再次消除手部的細菌和微生物。75%的酒精能殺滅手部95%以上的微生物。
定時或在任何關鍵操作前，應消毒手套
填寫批記錄后，手套應消毒
手的衛(wèi)生
每只手可攜帶40萬個細菌;
剛洗過的手，每平方厘米也可檢驗出3200個細菌。
洗手的重要性:
用流水（如自來水）洗手，能使手上的致病微生物減少80%；
用皂液充分洗手，再用自來水沖洗能使致病微生物減少95%。
洗手后正確使用消毒劑能使致病微生物減少到99%。
設備與微生物
設備的衛(wèi)生應從設備的設計開始，要求產(chǎn)塵少、脫落粒子少、易清洗、消毒和滅菌。設備與物料的接觸面不得與物料反應,不得吸附物料,設備的內表面材質要平整、光滑，凹凸不平的區(qū)域不僅不易清洗，而且易存留殘液等，它將成為微生物繁殖滋生的場所。管道的安裝要避免批與批之間的交叉污染,管道要能定期清洗消毒。
★防范措施:
①.建立相應的設備清潔保養(yǎng)制度及規(guī)程
②.保持一貫的清潔狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)污漬、污水、殘余物等應立即清除
③.機修人員在線維修設備時，應注意操作盡量減少對食品、藥品產(chǎn)生污染
④.對直接接觸食品、藥品的設備進行清潔驗證
環(huán)境與微生物
環(huán)境中的微生物種類繁多，主要有附著于塵埃上的從地面飛起的球菌屬（包括八疊球菌屬在內的好氧菌)﹔形成孢子的好氧性桿菌(如枯草芽孢桿菌)﹔青霉等霉菌的孢子等。微生物的存在嚴重影響著食品、藥品生產(chǎn)的安全,依次必須加以嚴格控制。
★防范措施:
①.合理的廠房布局及高效的空氣過濾系統(tǒng)
②.完善的潔凈區(qū)日常衛(wèi)生管理
③.每周進行空氣消毒(臭氧熏蒸)
④.定期對潔凈環(huán)境進行監(jiān)測
潔凈度測定包括:
微生物（懸浮粒子）
-浮游菌
-沉降菌
無菌藥品的生產(chǎn)所需的潔凈區(qū)可以分為四個級別
A 級：高風險操作區(qū)，如灌裝區(qū)、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區(qū)域及無菌裝配或連接操作的區(qū)域，應當用單向流操作臺（罩）維持該區(qū)的環(huán)境狀態(tài)。單向流系統(tǒng)在其工作區(qū)域必須均勻送風，風速為0.36-0.54m/s（指導值）。應當有數(shù)據(jù)證明單向流的狀態(tài)并經(jīng)過驗證。在密閉的隔離操作器或手套箱內，可使用較低的風速。
B 級：指無菌配制和灌裝等高風險操作A 級潔凈區(qū)所處的背景區(qū)域。
C 級和D 級：指無菌藥品生產(chǎn)過程中重要程度較低操作步驟的潔凈區(qū)。
以上各級別空氣懸浮粒子的標準與ISO14644-1中潔凈度等級（以≥0.5μm和≥5μm的懸浮粒子為限度標準）的關系.
制藥GMP車間潔凈度等級要求
潔凈區(qū)空氣懸浮粒子的標準(用塵埃粒子計數(shù)器檢測）
潔凈度等級
空氣中懸浮粒子最大允許濃度（個/m3）
靜態(tài)
動態(tài)
≥0.5 μm
≥5.0 μm
≥0.5 μm
≥5.0 μm
A級
3520
20
3520
20
B級
3520
29
352000
2900
C級
352000
2900
3520000
29000
D級
3520000
29000
不作規(guī)定
不作規(guī)定
潔凈區(qū)微生物監(jiān)測的動態(tài)等級標準（可用浮游菌采樣器檢測）
潔凈度等級
浮游菌
cfu/m3
沉降菌（φ90 mm）
cfu/4h
表面微生物
接觸（φ55 mm）
cfu/碟
5指手套
cfu/手套
A級
<1
<1
<1
<1
B級
10
5
5
5
C級
100
50
25
/
D級
200
100
50
/
注：此表摘自《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范2010版》
控制微生物污染途徑環(huán)境控制
懸浮粒子的要求:附錄1<無菌藥品>第九、十條
1、A級區(qū)確認時的采樣量不少于1m3
2、潔凈區(qū)的動態(tài)監(jiān)測
懸浮粒子的動態(tài)監(jiān)測
關鍵操作的全過程，對A級區(qū)進行粒子監(jiān)測
A級區(qū)的監(jiān)測頻率、取樣量，及時發(fā)現(xiàn)人為干預、偶發(fā)事件及任何系統(tǒng)的破壞
B級區(qū):類似于A級區(qū)，采樣頻率、采樣量可以調整
C級區(qū):質量風險管理原則確定
D級區(qū):一般不作要求，(法規(guī):必要時)
對于C/D級區(qū)的自凈時間應達到規(guī)定要求
微生物的要求:附錄1<無菌藥品>第十一條
監(jiān)測方法有:
空氣浮游菌監(jiān)測沉降菌法--被動法
定量空氣浮游菌采樣法--主動法
環(huán)境表面監(jiān)測
表面取樣法（如棉簽擦拭法和接觸碟法)
人員監(jiān)測
表面取樣法(接觸碟法)
1.空氣浮游菌監(jiān)測
沉降菌法--被動法
沉降碟在空氣中的暴露時間4小時監(jiān)控
整個灌裝過程
只能給出定性和半定量的數(shù)據(jù)
應結合空氣浮游菌的數(shù)據(jù),對沉降碟的結果進行評價
定量空氣浮游菌采樣法--主動法
搤擊式，離心式和膜過濾（明膠）取樣儀
應取一定體積的空氣(取樣體積應有代表性)
儀器應經(jīng)過校驗
2.環(huán)境表面監(jiān)測:表面取樣法
應對接觸產(chǎn)品表面、設備、地面、墻面等定期監(jiān)測接觸蝶法:適用于平整表面
取樣面積25cm2
培養(yǎng)基略有凸起，高于碟子邊緣,便于取樣
培養(yǎng)基中應含有中和劑/保護劑
棉簽擦拭法:適用于不規(guī)則表面
取樣面積~25cm2
定性或定量
表面樣應在無菌操作結束時取
以最大限度地降低無菌制造過程中關鍵表面污染的風險
3.人員監(jiān)測
表面取樣法（接觸碟法），取樣時間一般為:
工作結束，離開潔凈區(qū)前取樣
處理異常情況后（取樣后重新更衣或更換手套)。
生產(chǎn)過程中隨時監(jiān)測
特別注意:
不得在剛消毒過后取樣
日常環(huán)境監(jiān)測頻次：
測試項目
環(huán)境級別
測試頻率
A級
兩周1次
沉降菌/浮游菌
C級
一個月1次
D級
兩個月1次
A級/B級
兩周1次
懸浮粒子
C級
一個月1次
D級
兩個月1次
A級/C級
每班生產(chǎn)結束
手和操作服
C級
一個月1次
D級
三個月1次
潔凈區(qū)監(jiān)測的位置取樣位置選擇時考慮因素:
哪些部位的微生物污染最可能對產(chǎn)品質量造成不良影響?
在生產(chǎn)過程中，什么地點最容易長菌?
哪些地方是清潔、消毒或滅菌時最難覆蓋/接觸或最難奏效的部位?
什么活動會導致污染的擴散?
在某一部位的取樣操作，足以導致測試數(shù)據(jù)的差錯或污染產(chǎn)品﹖取樣只應在生產(chǎn)結尾換班時進行嗎?
潔凈區(qū)監(jiān)測的位置
應符合“GB16292-2010”、“GB16294-2010”的要求
基于風險的設計
監(jiān)測點設置在潛在風險最大的位置
a)食品、藥品
b)容器
c)連接處
d)人流和物流經(jīng)過的地方
e)監(jiān)測點靠近“工作高度”
示例:無菌灌裝線
取樣點應在產(chǎn)品或組件暴露的區(qū)域周圍取樣，如:
在灌裝針頭處
將產(chǎn)品裝載入凍干腔室處
膠塞供料桶
無菌部件進行連接操作的部位
操作人員頻繁活動處（不影響生產(chǎn)過程)
注意:靠近產(chǎn)品，但不接觸產(chǎn)品的位置
浮游菌、沉降菌取樣點
沉降菌、浮游菌:監(jiān)控點位置，高度一般為離地80cm左右，或操作臺面。
浮游菌、沉降菌監(jiān)控點的設置根據(jù)生產(chǎn)工藝及污染風險綜合考慮。
潔凈區(qū)表面微生物取樣點
C級區(qū)取樣點:一般為地面、墻面及操作人員十指手套。對C級下的局部A級區(qū)取樣宜在生產(chǎn)結束后進行，避免造成污染。
環(huán)境監(jiān)測常用儀器/設備/培養(yǎng)基
懸浮粒子 浮游菌 表面微生物檢測 沉降菌
預制培養(yǎng)平板包裝
無菌區(qū)使用預制平板:一般采用三層包裝形式:
預制平板進入潔凈區(qū)
預制平板進入無菌區(qū)，須避免對監(jiān)控區(qū)域的污染。
預制平板脫包裝
經(jīng)傳遞窗進入潔凈區(qū)的預制培養(yǎng)平板繼續(xù)脫去外面兩層包裝就可以使用。
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