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什么？！按照轉(zhuǎn)錄組篩選的5個(gè)最明顯的差異基因只有2個(gè)與qRT-PCR結(jié)果一致？

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）將細(xì)胞內(nèi)某一類型（或全部）的RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，通過高通量測序的方法測定其序列并統(tǒng)計(jì)其表達(dá)水平的一項(xiàng)技術(shù)。是檢測基因表達(dá)變化的通用方法。qRT-PCR 是指通過對 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。

RNA-seq無需知道實(shí)驗(yàn)樣本的基因組序列含比傳統(tǒng)定量更多的信息，RNA-seq覆蓋的范圍更廣，更精確。 一般而言RNA-seq是大規(guī)模篩選用的，反應(yīng)樣本整體的基因表達(dá)變化趨勢，但不能保證每一個(gè)基因的變化趨勢都與qPCR保持一致。2017年5月，來自比利時(shí)根特大學(xué)的Celine系統(tǒng)的闡述了這個(gè)問題。（Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組不管采用何種方法 ，RNA-seq與RT-PCR相關(guān)性在0.8左右，有15.1%-19.4%的RNA-seq結(jié)果與RT-PCR對應(yīng)不上，non-concordant序列中有1.6%-2.8%與RT-PCR結(jié)果完全相反如下圖：

這些non-concordant序列的共同的特點(diǎn)是序列較短和外顯子少，但與GC含量和同源基因的多少沒有關(guān)系。造成這些序列non-concordant的原因有很多，包括原始數(shù)據(jù)的過濾、接頭引物的選擇和分析方法等有關(guān)。

因此，我們拿到RNA-seq與RT-PCR結(jié)果不一致的話：

首先需要看進(jìn)行不一致的程度分析：

    A.驗(yàn)證30個(gè)基因，25個(gè)表達(dá)趨勢一致；

    B.驗(yàn)證30個(gè)基因，15個(gè)表達(dá)趨勢一致；

    C.驗(yàn)證30個(gè)基因，5個(gè)表達(dá)趨勢一致；

    D.驗(yàn)證3個(gè)基因，1個(gè)表達(dá)趨勢一致。

其次思考可能存在的原因在哪里？

    如D情況，驗(yàn)證基因數(shù)太少，隨機(jī)出現(xiàn)的概率會比較大，屬于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理，不作為討論范圍。

    如A情況，屬于結(jié)果一致，為了更好的表示是否一致，建議計(jì)算30個(gè)基因的相關(guān)性系數(shù)，趨勢只反映上下調(diào)，不能反映倍數(shù)。一般相關(guān)性系數(shù)大于0.8，說明一致性較好。

    如C情況，優(yōu)先考慮是否是實(shí)驗(yàn)組與對照組在某個(gè)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置顛倒。

    如B情況，相對復(fù)雜，需要一步一步來排查：能夠出現(xiàn)問題的點(diǎn)，無非是驗(yàn)證設(shè)計(jì)有問題？QPCR結(jié)果不準(zhǔn)確？轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不準(zhǔn)確？

    驗(yàn)證設(shè)計(jì)有問題：

                1.樣本是否是同一批次樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和QPCR分析？

                2.挑選驗(yàn)證基因時(shí)，挑選的基因是否序列較短或者外顯子較少？

                3.是否低表達(dá)的基因比例過高（對于低表達(dá)基因，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量結(jié)果準(zhǔn)確性偏低）？

    QPCR結(jié)果不準(zhǔn)確：

                                  1.查找實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)是夠存在問題？

                                  2. 內(nèi)參基因是否穩(wěn)定？

    轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不準(zhǔn)確：

                    1.查看插入片段隨機(jī)性分布，是否存在5'端嚴(yán)重降解？

                    2.查看比對效率是否正常？查看樣本間的相關(guān)性系數(shù)，是否存在組內(nèi)小于組間？

3.分析差異表達(dá)的基因的readcount一般在多少比較比較合適？

            一般認(rèn)為多個(gè)樣本中，至少有一個(gè)樣本的3次生物學(xué)重復(fù)的readcount≥10；

            如果進(jìn)行RT-pcr驗(yàn)證，建議選擇至少有一個(gè)樣本的3次生物學(xué)重復(fù)的readcount≥20.

原始文獻(xiàn)：

Everaert C, Luypaert M, Maag J L V, et al. Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1559.

相關(guān)文獻(xiàn)：

1. Christelle R, Watson M. Errors in RNA-Seq quantification affect genes of relevance to human disease[J]. Genome Biology, 2015, 16.

2. Teng M, Love M I, Davis C A, et al. A benchmark for RNA-seq quantification pipelines[J]. Genome biology, 2016, 17(1): 74.