論文標(biāo)題：Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation
作者：Saiyu Hang, Donggi Paik, Lina Yao, Eunha Kim, Trinath Jamma, Jingping Lu, Soyoung Ha, Brandon N. Nelson, Samantha P. Kelly, Lin Wu, Ye Zheng, Randy S. Longman, Fraydoon Rastinejad, A. Sloan Devlin, Michael R. Krout, Michael A. Fischbach, Dan R. Littman, Jun R. Huh
查看更多
期刊：Nature
發(fā)表時(shí)間：2019/11/27
數(shù)字識(shí)別碼：10.1038/s41586-019-1785-z
摘要：Bile acids are abundant in the mammalian gut, where they undergo bacteria-mediated transformation to generate a large pool of bioactive molecules. Although bile acids are known to affect host metabolism, cancer progression and innate immunity, it is unknown whether they affect adaptive immune cells such as T helper cells that express IL-17a (TH17 cells) or regulatory T cells (Treg cells). Here we screen a library of bile acid metabolites and identify two distinct derivatives of lithocholic acid (LCA), 3-oxoLCA and isoalloLCA, as T cell regulators in mice. 3-OxoLCA inhibited the differentiation of TH17 cells by directly binding to the key transcription factor retinoid-related orphan receptor-γt (RORγt) and isoalloLCA increased the differentiation of Treg cells through the production of mitochondrial reactive oxygen species (mitoROS), which led to increased expression of FOXP3. The isoalloLCA-mediated enhancement of Treg cell differentiation required an intronic Foxp3 enhancer, the conserved noncoding sequence (CNS) 3; this represents a mode of action distinct from that of previously identified metabolites that increase Treg cell differentiation, which require CNS1. The administration of 3-oxoLCA and isoalloLCA to mice reduced TH17 cell differentiation and increased Treg cell differentiation, respectively, in the intestinal lamina propria. Our data suggest mechanisms through which bile acid metabolites control host immune responses, by directly modulating the balance of TH17 and Treg cells.
查看更多
膽汁酸為膽固醇來(lái)源的天然表面活性劑，由肝細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞色素P450氧化膽固醇生成并分泌至十二指腸。哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)膽汁酸含量豐富，可由腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化成大量具有生物活性的小分子庫(kù)進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)消化、抗菌防御及葡萄糖代謝【1-2】。圖1顯示的是膽汁酸生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝途徑【2】。大多數(shù)膽汁酸可經(jīng)小腸末端的回腸重吸收并循環(huán)回到肝臟，而部分膽汁酸可經(jīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化至具有多樣化學(xué)結(jié)構(gòu)的次級(jí)膽汁酸。在正常人群的腸道，膽汁酸可保護(hù)腸道上皮細(xì)胞并對(duì)病原菌產(chǎn)生抵抗，提示這些膽汁酸具有潛在的調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的功能。
圖1. 膽汁酸生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝途徑。哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的膽汁酸包括初級(jí)膽汁酸 (膽酸CA、鵝脫氧膽酸CDCA)及次級(jí)膽汁酸(脫氧膽酸DCA及石膽酸LCA)。本圖來(lái)自參考文獻(xiàn)【2】
2019年11月28日，來(lái)自美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系的Jun Huh課題組，聯(lián)合紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dan Littman課題組及斯坦福大學(xué)Michael Fischbach課題組（共同一作為Saiyu Hang和Donggi Paik）在Nature雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation的研究論文，通過(guò)對(duì)膽汁酸代謝物化合物的篩選，發(fā)現(xiàn)了石膽酸LCA兩種不同的代謝產(chǎn)物(3-oxoLCA和isoalloLCA)可在小鼠上調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，提示膽汁酸代謝物可通過(guò)直接調(diào)控TH17和Treg細(xì)胞平衡，從而調(diào)控宿主免疫。
首先，研究人員為尋找調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的膽汁酸，對(duì)近30個(gè)初級(jí)和次級(jí)膽汁酸在內(nèi)的化合物進(jìn)行篩選。研究人員使用野生型C57BL/6小鼠(B6Jax小鼠)分離出初始CD4+ T細(xì)胞，并在TH17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化狀態(tài)下與膽汁酸共培養(yǎng) (圖2) ，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)石膽酸衍生物能顯著影響TH17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化：(1) 3-oxoLCA可抑制TH17細(xì)胞分化，表現(xiàn)在顯著降低的IL-17a；(2) isoalloLCA可促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，表現(xiàn)在FOXP3表達(dá)的增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3-oxoLCA作用于TH17細(xì)胞和isoalloLCA作用于Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)效應(yīng)具有細(xì)胞類(lèi)型特異性，且兩個(gè)衍生物均不影響T細(xì)胞分化至TH1或TH2型T輔助細(xì)胞。
圖2. 膽汁酸代謝物篩選方法
隨后的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分欲揭示3-oxoLCA如何抑制TH17細(xì)胞分化。此前Jun Huh博士在Dan Littman組博后訓(xùn)練期間，曾發(fā)表Nature論文，報(bào)道了地高辛及其衍生物可作為T(mén)H17細(xì)胞抑制劑，這是因?yàn)榈馗咝辆哂泄檀紭咏Y(jié)構(gòu)【3】，通過(guò)結(jié)合并抑制RORγt來(lái)發(fā)揮效應(yīng)。隨后，Dan Littman組陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種具有類(lèi)似膽固醇結(jié)構(gòu)的化合物可成為RORγt調(diào)節(jié)劑【4】。因此，研究人員進(jìn)一步想知道的是，3-oxoLCA在體外系統(tǒng)是否可以與RORγt蛋白相互作用。通過(guò)熱遷移實(shí)驗(yàn)，研究人員證實(shí)了3-oxoLCA 可結(jié)合至RORγt配體結(jié)合域，且平衡解離常數(shù)遠(yuǎn)低于另外兩個(gè)3-oxoLCA結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。隨后的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了3-oxoLCA可抑制RORγt轉(zhuǎn)錄活性。因此，這一部分實(shí)驗(yàn)證明，3-oxoLCA可能通過(guò)與RORγt相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄活性從而抑制TH17細(xì)胞分化。
第二部分實(shí)驗(yàn)欲證明isoalloLCA如何促進(jìn)Treg細(xì)胞分化。由于LCA具有三個(gè)同分異構(gòu)體，iaoLCA、alloLAC及isoalloLCA，其中isoalloLCA具有最低的logD值，與已報(bào)道的鵝脫氧膽酸及熊脫氧膽酸近似，提示isoalloLCA與其他同分異構(gòu)體相比，親脂性更低。小鼠分離初始CD4+ T細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明了isoalloLCA可提高FOXP3表達(dá)，且進(jìn)一步被FOXP3-GFP報(bào)告小鼠分離出的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)佐證。而FOXP3轉(zhuǎn)錄可通過(guò)CNS1、CNS2和CNS3三個(gè)非編碼增強(qiáng)子調(diào)節(jié)，因此，研究人員通過(guò)流式細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí)，isoalloLCA發(fā)揮FOXP3促進(jìn)效應(yīng)需要CNS3。那么，其他已知的T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子是否也參與這一促進(jìn)效應(yīng)？研究人員研究了其他轉(zhuǎn)錄因子，排除了REL、VDR、FXR的參與。此前有報(bào)道稱(chēng)，CNS3可能在Foxp啟動(dòng)子區(qū)域存在表觀(guān)修飾，從而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞發(fā)育，因此研究人員進(jìn)行ChIP分析，發(fā)現(xiàn)了經(jīng)isoalloLCA處理后，F(xiàn)oxp啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27ac及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300水平顯著增加，而H3K4甲基化不受影響。因此，這部分實(shí)驗(yàn)證明，CNS3的作用為建立許可性的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得啟動(dòng)子區(qū)域可在isoalloLCA處理后進(jìn)一步乙酰化。
細(xì)胞代謝和表觀(guān)修飾息息相關(guān)，且已知的是，Treg細(xì)胞主要依賴(lài)于氧化磷酸化以進(jìn)行能量生成。因?yàn)?，下一步需要回答的?wèn)題是，isoalloLCA是否影響氧化磷酸化？研究發(fā)現(xiàn)，isoalloLCA處理后可顯著增加氧消耗量，提示isoalloLCA可增強(qiáng)線(xiàn)粒體活性。為證明這一假設(shè)，研究人員分別比較了isoalloLCA對(duì)線(xiàn)粒體ROS水平和胞漿ROS水平的影響，并使用線(xiàn)粒體靶向抗氧化劑進(jìn)行反向驗(yàn)證。進(jìn)一步通過(guò)Foxp3啟動(dòng)子區(qū)域H3K27ac的分析，研究人員證實(shí)了isoalloLCA促進(jìn)Treg細(xì)胞分化的兩個(gè)機(jī)制，(1) 提高線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)量；(2) 增加Foxp3啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27乙?；?nbsp;(圖3)。
圖3. 膽汁酸代謝物isoalloLCA促進(jìn)Treg細(xì)胞分化的示意圖
最后，研究人員想要回答的問(wèn)題是，3-oxoLCA和isoalloLCA在小鼠在體模型上是否也可以影響TH17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化呢？此前，Littman組在Cell發(fā)文報(bào)道，小腸內(nèi)的節(jié)絲狀菌SFB能促進(jìn)TH17細(xì)胞分化【5】。當(dāng)時(shí)，研究人員比較了Taconic公司及Jackson公司兩種來(lái)源的小鼠，這是因?yàn)門(mén)aconic來(lái)源的C57BL/6J小鼠 (B6 Tac小鼠) 腸道存在SFB，因此具有大量TH17細(xì)胞，而B(niǎo)6 Jax小鼠因缺乏SFB而具有較少的腸道TH17細(xì)胞 (見(jiàn)圖4，來(lái)自L(fǎng)ittman組該Cell文章) 。
圖4. Jackson及Taconic來(lái)源C57BL/6小鼠回腸末端腸道菌的比較分析 (來(lái)自參考文獻(xiàn)【5】)
基于此前期研究，本文中，研究人員對(duì)B6 Jax小鼠灌胃給與含SFB的糞便顆粒，隨后給與正常飼料或含3-OxoLCA飼料達(dá)一周，使得體內(nèi)3-oxoLCA含量達(dá)到足以抑制TH17細(xì)胞分化的濃度 (圖5) 。研究人員發(fā)現(xiàn)，給與3-oxoLCA能顯著抑制回腸 TH17細(xì)胞比率，而天然含有SFB細(xì)菌的B6 Tac小鼠在喂食3-oxoLCA后也表現(xiàn)出TH17細(xì)胞比率的顯著下降 (圖5 a&b) ，而兩種條件下喂食3-oxoLCA均不影響Treg細(xì)胞比率。使用近似手段，研究人員發(fā)現(xiàn)，另一種代謝物isoalloLCA單獨(dú)喂食并不足以提高靜息態(tài)下Treg細(xì)胞比率，而在使用anti-CD3處理后的小鼠上，與3-oxoLCA聯(lián)合使用能顯著增加Treg細(xì)胞比率，與體外實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到的3-oxoLCA可進(jìn)一步增強(qiáng)isoalloLCA的Treg細(xì)胞分化效應(yīng) (圖5 c&d) 。進(jìn)一步對(duì)腸道菌群的分析提示，3-OxoLCA及isoalloLCA對(duì)TH17及Treg細(xì)胞的調(diào)控作用并不影響腸道共生菌，提示3-oxoLCA及isoalloLCA可在小鼠體內(nèi)直接調(diào)控TH17及Treg細(xì)胞。
圖5. 在體實(shí)驗(yàn)證明，3-OxoLCA可抑制TH17細(xì)胞發(fā)育，而isoalloLCA可提高Treg細(xì)胞
另外，研究人員還對(duì)腸道內(nèi)的膽汁酸代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3-oxoLCA 和 isoalloLCA 都存在于人體內(nèi)。更重要的是，在無(wú)菌小鼠體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩種代謝物，只有普通有菌小鼠體內(nèi)存在，提示這些代謝物是腸道共生菌的代謝產(chǎn)物。那么究竟哪些細(xì)節(jié)可以代謝膽汁酸，并且影響體內(nèi)T細(xì)胞功能呢？筆者了解到，與Jun Huh課題組相鄰的哈佛醫(yī)學(xué)院另外一個(gè)課題組——Kasper課題組，近期將有另外一篇Nature文章來(lái)詳細(xì)解答這個(gè)問(wèn)題。
據(jù)悉，在本文的審稿過(guò)程中，同行評(píng)議認(rèn)為本文提出了一個(gè)新穎而及時(shí)的概念，并概述了兩種非冗余機(jī)制，合成膽汁酸衍生物可通過(guò)這些機(jī)制調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育和功能。該研究在TH17 和Treg細(xì)胞分化的背景下表征了次級(jí)膽汁酸的功能，這使其成為將腸道微生物衍生產(chǎn)品與腸道功能聯(lián)系起來(lái)的有效機(jī)制研究，明確揭示了膽汁酸可發(fā)揮非常重要的調(diào)節(jié)功能，并參與塑造機(jī)體免疫系統(tǒng)。
參考文獻(xiàn)：
1. Shapiro et al., (2018) J Exp Med. Bile acids in glucose metabolism in health and disease. 215(2):383-396.2. Jia et al. (2018) Nat Rev Gastroenterol Hepatol. Bile acid-microbiota crosstalk in gastrointestinal inflammation and carcinogenesis. 15(2):111-6128.3. Huh et al., (2011) Nature. Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagonizing RORγt activity. 472(7344):486-904. Santori et al., (2015) Cell Metabolism. Identification of natural RORγ ligands that regulate the development of lymphoid cells. 21(2):286-2985. Ivanov et al., (2009) Cell. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. 139(3):485-98
