在許多細菌和古細菌中， CRISPR 形成了獨特的遺傳基因座，這些基因座特異性靶向病毒核酸，從而獲得了針對病毒的免疫力。且隨著時間的推移建立起可遺傳的編碼免疫力。與此同時，病毒也不斷在改變逃避策略，來繞開 CRISPR 系統(tǒng)。
于是，在生命進化史上，CRISPR 系統(tǒng)便成了細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器。
CRISPR/Cas
CRISPR/Cas 系統(tǒng)——由一小段 RNA 和一種高效的 DNA 切割酶 (Cas 核酸酶) 組成的系統(tǒng)。
CRISPR (Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats; 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列) 是一種抵御外源 DNA 的免疫機制。
CRISPR 主體為 CRISPR 基因座 (CRISPR Array): 由多個重復序列 (Repeats)和間隔序列 (Spacers) 組成。
圖 1. CRISPR/Cas 結構[2]
Cas (CRISPR-associated genes; CRISPR 相關基因): 可在 CRISPR 序列左側 (圖 1) 或右側。
Leader (前導序列): 300-500 個堿基組成，位于 CRISPR 的 5' 端，與第一個重復序列直接相連，是一段相對保守的 AT 富集區(qū)。Leader 是新插入序列的識別位點，也能作為啟動子，啟動 CRISPR 基因座的轉錄。有些細菌無前導序列，如大腸桿菌。
CRISPR/Cas9
在細菌及古細菌中，CRISPR 系統(tǒng)共分成 3 類，其中 I 類和 Ⅲ 類需要多種 CRISPR 相關蛋白 (Cas 蛋白) 共同發(fā)揮作用。而來自Streptococcus pyogenes的 Ⅱ 型系統(tǒng)只需要一種 Cas 蛋白 (Cas9) 即可發(fā)揮核酸內切酶活性。因此，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用最為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞。
CRISPR/Cas9 作用機制
第一步: 捕獲外源 DNA
圖 2. CRISPR/Cas9 操作第一步[6]
當噬菌體等外源 DNA 入侵時，CAS1/2 復合體通常識別 3' 端含 NGG 的前間隔序列鄰近基序 (PAM) 區(qū)域。然后，前間隔序列 (Protospacer) 被剪切下來，作為間隔序列插入宿主 CRISPR 位點中，由重復序列隔開。PAM 序列結構簡單，幾乎可在所有基因中找到，因此得到廣泛的應用。
第二步: crRNA 合成
圖 3. CRISPR/Cas9 操作第二步[6]
CRISPR 序列轉錄，形成前體 CRISPR RNA (pre-crRNA)，然后在 Cas9 蛋白的幫助下，被剪切成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA 。II 型 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中，這一步由 Cas9 及 RNase III 共同完成。對 pre-crRNA 的剪切需要先合成一段反式激活 crRNA (tracrRNA)。tracrRNA 中有部分堿基序列與 pre-crRNA 上的重復序列存在嚴格的堿基互補關系。Cas9 及 RNase III 只有在 tracrRNA 與 pre-crRNA 上的重復序列配對形成雙鏈 RNA 的條件下，才能對 pre-crRNA 進行剪切，剪切后，形成成熟的 tracrRNA-crRNA 雙鏈 RNA。tracrRNA-crRNA 雙鏈體被稱為 gRNA。Cas9 核酸酶和 gRNA 形成 Cas9 核糖核蛋白 (RNP)。
改造后的 CRISPR/Cas9 將 tracrRNA 和 crRNA 融合成一條單鏈引導 RNA (sgRNA)。sgRNA 可以從單個質粒表達，用于直接轉染或包裝成用于病毒轉導的顆粒。
另外，可通過與一些熒光物質融合，來可視化活細胞中的內源性基因組位點。如下圖的熒光小分子 DFHBI (
HY-110250)。
圖 4. DFHBI 用于檢測 Cas 核酸酶活性[8]
第三步: 靶向干擾
圖 5. CRISPR/Cas9 操作第三步[6]
當外源 DNA 再次進入細胞時，Cas9 蛋白攜帶 gRNA，去識別外源 DNA 的 Protospacer (前間隔序列)，并與之結合，通過 Cas9 解旋酶和核酸酶對靶基因進行剪切。造成靶基因 DNA 的雙鏈斷裂 (DSB)，從而達到干擾靶基因表達的目的。
Cas9 的酶切活性被激活的兩個條件:
1. 通過 crRNA 中的間隔序列與靶基因 DNA 的 Protospacer 互補配對。
2. Cas9 蛋白必須識別靶基因 DNA 上的 PAM 序列 NGG。
綜上，CRISPR 技術主要是利用位點特異 Cas 核酸酶在基因組靶位點處引入 DNA DSB，再經(jīng)細胞自身的非同源末端連接 (NHEJ) 或同源重組修復 (HDR) 對 DSB 進行修復，最終實現(xiàn)目標基因敲除和堿基編輯等基因組遺傳修飾。
DNA 修復
圖 6. DNA 兩種修復機制[6]
非同源末端連接 (NHEJ): 哺乳動物中很普遍，是 DNA 雙鏈斷裂的主要修復方式，多種修復酶強行將兩個 DNA 雙鏈斷端連接一起，是一種易錯修復，易在 DSB 位點出現(xiàn) DNA 堿基的缺失或者插入，引起基因編碼區(qū)閱讀框的改變。NHEJ 修復過程不依賴于同源 DNA 序列，核心成分是具有催化作用的 DNA-PK，Ku70 和 Ku80，及 DNA 連接酶 IV 等。NHEJ 不限于細胞周期的某個階段，可在細胞周期的任一時期發(fā)生。
同源重組修復 (HDR): HDR 修復過程需要姐妹染色單體作為修復模板，以同源重組的方式在 DSB 處生成所需要的序列替換，實現(xiàn)基因定點刪除，插入，或者基因矯正，具有準確性和復雜性。而 HDR 在細胞周期的 S 和 G2 階段起作用。
在細胞內，NHEJ 的發(fā)生率遠高于 HDR，為了提高同源重組介導的精準修復就需要提高 HDR 的發(fā)生頻率。通過抑制 NHEJ 修復途徑的發(fā)生可以提高同源重組修復的效率。
CRISPR/Cas9 介導的 NHEJ 與 HDR
CRISPR 系統(tǒng)靶向結合特異性的 DNA 序列，誘導靶 DNA 雙鏈發(fā)生精確切割。DSB 的產生刺激 DNA 損傷修復過程。提高基因組精準編輯效率。
抑制 NHEJ 修復途徑相關化合物
SCR7是有效的 DNA 連接酶 IV 抑制劑，DNA 連接酶 IV 是 NHEJ 途徑中的關鍵酶。
NU7441高度選擇性的 DNA-PK 抑制劑，DNA-PK 在 NHEJ 修復中起關鍵作用。
增強 HDR 修復途徑相關化合物
RS-1HDR 激活劑，可提高 Cas9 介導的敲入效率。
Nocodazole細胞周期抑制劑，將細胞周期阻滯在 G1/S 期或者 G2/M 期，以提高 HDR 效率 (NHEJ 修復途徑可在細胞周期的任一時期發(fā)生，而同源重組修復途徑只在細胞周期的 S 期以及 G2 期發(fā)生)。
L755507β3-腎上腺素能受體激動劑; 增強 CRISPR 介導的 HDR 效率。
Brefeldin A蛋白轉運抑制劑，抑制蛋白從內質網(wǎng)向高爾基體轉運; 增強 CRISPR 介導的 HDR 效率。
CRISPR 的應用
CRISPR 技術已經(jīng)用于多種不同疾病的研究，包括遺傳性血液病鐮刀狀細胞貧血癥，萊伯氏先天性黑蒙癥，泰伊-薩克斯二氏病等。基于 CRISPR/Cas 系統(tǒng)而來的高通量基因組編輯技術和低成本突變檢測方法也在禾谷類作物中不斷得到發(fā)展與應用。
萊伯氏先天性黑蒙癥 (Leber congenitalamaurosis; LCA) 是一種由中心體蛋白 290 (CEP290) 基因突變引起的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病，由至少 18 個不同基因的突變引起。該病是遺傳性兒童失明最常見的原因。眼科基因編輯療法 AGN-151587 (EDIT-101) 已進入 I/II 期臨床研究 NCT03872479。
AGN-151587 是一種腺相關病毒 AAV5 病毒載體，裝載了 3 個成分，包括: 由 U6 聚合酶 III 啟動子控制的 2 個指導 RNA (gRNA) RNA-323 和 gRNA-64，以及通過光受體特異性 GRK1 啟動子表達的金黃色葡萄球菌 Cas9。
圖 7. EDIT-101 示意圖[9]
不同劑量的 AGN-151587 注射到視網(wǎng)膜下，將基因編輯系統(tǒng)遞送到感光細胞中。當感光細胞表達基因編輯系統(tǒng)時，gRNA 指導的基因編輯可以消除或逆轉 CEP290 基因上致病的 IVS26 突變，從而改善感光細胞功能。由于 Cas9 由光受體特異性 GRK1 啟動子控制，因此該系統(tǒng)只在感光細胞內發(fā)生基因編輯，從而將潛在副作用最小化。CRISPR 基因編輯是永久性的，意味著可能只需要一次注入就可以終身改善視力。
Tips
CRISPR 對靶基因敲除后，可使用 qPCR Mix (
HY-K0510,
HY-K0511,
HY-K0501,
HY-K0521,
HY-K0522,
HY-K0523) 進行 qPCR 檢測靶基因的mRNA 表達水平來衡量敲除效率。也可使用蛋白酶抑制劑 Cocktail (
HY-K0010,
HY-K0011)，RIPA 裂解液 (
HY-K1001)，Protein Marker (
HY-K1011) 和 ECL 化學發(fā)光試劑盒 (
HY-K1005) 進行 Western blot 檢測靶基因的蛋白表達水平來衡量敲除效率。
CRISPR gRNA/Cas 9 質粒載體
SpCas9 載體
來源于化膿性鏈球菌，是一種高效、精準的基因編輯載體，編輯范圍大，但是不能被包裝在 AAV 病毒中用于基因治療。
當與 gRNA 序列結合后，這些 Cas9 蛋白可在特定位點上進行基因組雙鏈斷裂。因其簡捷性，特異性以及高效性，在基因組編輯中廣泛使用。SpCas9 出現(xiàn)兩個連續(xù)的 G 序列就可以進行編輯，SaCas9 需要四個堿基組合才能編輯，這樣出現(xiàn)的頻率低。
SaCas9 載體來源于金黃色葡萄球菌，是第一個被用于基因治療研究的小型 CRISPR/Cas9 載體，編輯范圍小。SaCas9 長度比 SpCas9 小。
SaCas9 的主要優(yōu)勢是腺相關病毒 (AAV) 包裝：AAV 載體將 SpCas9 與 AAV 包裝在一起可能具有挑戰(zhàn)性。相對較小的 SaCas9 利用 AAV 載體進行 CRISPR 基因編輯成為可能?？紤]到這一結構的免疫原性較低，因此 SaCas9 更適合于體內編輯應用，如用于治療。
Tips
在進行病毒感染實驗時，可以用含有青鏈霉素雙抗 (
HY-K1006) 或其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基稀釋。
CRISPR 2.0
經(jīng)典的 CRISPR 技術無法與基因組的任意部位結合，有時甚至可能會切割錯誤的位置。且沒有關閉按鈕，可能會導致過量切割，產生脫靶效應。對此，科學家們通過一系列研究，篩選出針對 CRISPR-Cas9 的小分子抑制劑 (如
HY-136251, BRD0539 是一種 CRISPR/Cas9 小分子抑制劑，可有效抑制 SpCas9)，使得對 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)有了更有效的控制?？傊词褂兄@樣那樣的局限性，但經(jīng)典 CRISPR 系統(tǒng)依然是生物學中非常重要的工具。
被稱為 "CRISPR 2.0" 的堿基編輯 (Base Editing)——可以進入到細胞中選定的 DNA 位點，直接將一個堿基轉換為另一個堿基，而不會造成 DNA 雙鏈斷裂。
CRISPR 2.0 方法并不是要替代傳統(tǒng)的 CRISPR 基因編輯技術，而是為治療某些疾病提供其他可選的方案。
如果目標是要插入或敲除某些 DNA 堿基，CRISPR-Cas9 這種方式還是非常有效的。如果目標僅僅是修復某個點突變，堿基編輯 (CRISPR 2.0) 是一種更安全有效的方式。
歲月悠悠，唯有時間能證明 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是不是最合適的基因編輯工具。目前還需要進行大量的實踐，同時推進所有這些系統(tǒng)的研究。希望在不久的將來，基因編輯技術能安全地應用到人類疾病治療、農作物培育等各個方面。
END
