本文解讀的文獻(xiàn)標(biāo)題如下
The circRNA circAGFG1 acts as a sponge of miR-195-5p to promote triple-negative breast cancer progression through regulating CCNE1 expression
通過高通量測序和后續(xù)的功能驗證，挖掘出三陰性乳腺癌中的一個ceRNA調(diào)控功能網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)址如下
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-018-0933-7
三陰性乳腺癌是最為惡性的一種乳腺癌亞型，占所有乳腺癌病理類型的15%左右，對應(yīng)癌組織的免疫組織化學(xué)檢驗結(jié)果為雌激素受體(ER), 孕激素受體(FR), 原癌基因(Her-2)三者均為陰性，其名稱也由此而來，簡稱TNBC。該疾病在年輕女性中更為常見，由于缺少相應(yīng)的分子靶點研究，化療是目前唯一有效的治療方式，但是復(fù)發(fā)率高，而且預(yù)后效果差。
環(huán)狀RNA是一類新星的非編碼RNA,具有重要調(diào)控功能，相關(guān)研究表明，環(huán)狀RNA在多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。環(huán)狀RNA可以作為miRNA sponge, 與miRNA結(jié)合，從而和該miRNA的其他靶標(biāo)分子形成競爭關(guān)系，構(gòu)成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，關(guān)于ceRNA機(jī)制的研究在多種癌癥中被報道。
本文以環(huán)狀RNA在三陰性乳腺癌中的作用為切入點，嘗試去尋找相應(yīng)的分子靶點，綜合了高通量測序，TCGA公共數(shù)據(jù)挖掘，功能驗證等多種手段來進(jìn)行分析，概括如下
首先從4個TNBC患者采集了癌和癌旁組織進(jìn)行RNA_seq測序，構(gòu)建去rRNA的文庫，進(jìn)行mRNA和circRNA的表達(dá)譜分析。對于環(huán)狀RNA表達(dá)譜，以fold change 大于2，p值小于0.05為閾值，篩選出了354個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA, 其中47個上調(diào)，307個下調(diào)， 火山圖結(jié)果如下
根據(jù)fold change分別從上調(diào)和下調(diào)的環(huán)狀RNA中挑選10個最顯著的環(huán)狀RNA繪制熱圖，結(jié)果如下
對于mRNA的表達(dá)譜，相同的閾值篩選出了3225個差異的mRNA,其中1007個上調(diào)，2218個下調(diào)，同樣的方法挑選20個差異的mRNA,熱圖如下所示
其中CCNE1這個基因的表達(dá)量差異最大，fold chang為19.36, 所以后續(xù)鎖定這個基因來進(jìn)行驗證。
對于差異基因，通過KEGG富集分析和GSEA兩種方法分析富集到的通路，結(jié)果如下所示
兩種結(jié)果中，都顯示cell cycle這個通路被富集到。
通過PCR驗證circAGFG1的存在, 并進(jìn)行一代測序，獲得該環(huán)狀RNA的序列信息，結(jié)果如下如下，其中527bp就是該環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄本長度，和circBase數(shù)據(jù)庫中的記錄一致
通過qRT-PCR驗證環(huán)狀RNA的差異，采用40個病人配對的癌和癌旁組織，共80個樣本進(jìn)行驗證，結(jié)果如下
通過circAGFG1的表達(dá)量區(qū)分正常組織和癌組織，對應(yīng)的ROC曲線如下所示
AUC大于0.5，說明可以有效的區(qū)分正常組織和癌組織。
通過生存分析發(fā)現(xiàn)circAGFG1的表達(dá)量與患者生存時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，生存曲線如下
通過cox回歸分析， 發(fā)現(xiàn)了TNM和circAGFG1的表達(dá)量這兩個因素與生存時間顯著相關(guān)，結(jié)果如下
通過卡方檢驗分析circAGFG1和病人臨床特征之間的相關(guān)性，結(jié)果如下
T和N對應(yīng)的p值小于0.05，即環(huán)狀RNA與原發(fā)部位腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。
對于選定的CCNE1基因，首先通過RT-PCR驗證差異，結(jié)果如下
利用TCGA數(shù)據(jù)庫中收集的TNBC和正常組織的樣本，進(jìn)行差異分析和生存分析，結(jié)果如下
通過泊松相關(guān)分析探究circAGFG1和CCNE1之間的相關(guān)性，結(jié)果如下
發(fā)現(xiàn)二者成正相關(guān)關(guān)系。由于circAGFG1和CCNE1之間的正相關(guān)性，推測通過ceRNA機(jī)制來調(diào)控疾病過程。
通過ArrayStar提供的mirna結(jié)合位點預(yù)測軟件預(yù)測circAGFG1結(jié)合的miRNA, 發(fā)現(xiàn)circAGFG1與miRNA-195-5p存在結(jié)合，結(jié)果如下
然后通過熒光原位雜交FISH技術(shù)，定位miRNA-195-5p和circAGFG1在細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)果如下所示
再通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證環(huán)狀RNA和miRNA之間的結(jié)合，野生型質(zhì)粒中熒光值相對下調(diào)，證明circAGFG1和miR-195-5p存在直接的相互作用。
進(jìn)一步通過設(shè)計circAGFG1 pull down芯片，驗證和miRNA的結(jié)合，結(jié)果如下
相比對照探針，在circAGFG1探針富集結(jié)果中檢測到了對應(yīng)的環(huán)狀RNA和miRNA。
對于找到的miRNA-195-5p, 同樣做了RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)在腫瘤中表達(dá)量下調(diào)，結(jié)果如下
TCGA的分析結(jié)果和自己的數(shù)據(jù)是一致的，都是下調(diào)，生存分析顯示miR-195-5p和生存時間正相關(guān)。
根據(jù)TargetScan的分析結(jié)果，CCNE1和miRNA-195-5p存在相互作用，同樣通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)來驗證，結(jié)果如下
分別驗證了circRNA-miRNA和mRNA-miRNA的相互作用之后，進(jìn)一步驗證circRNA和mRNA的調(diào)功關(guān)系，通過敲低和過表達(dá)circAGFG1, 利用RT-PCR研究circAGFG1和CCNE1表達(dá)量的關(guān)系，結(jié)果如下
在兩種不同的TNBC組織中，候選的circRNA和mRNA都呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。
通過以上的各種證據(jù)，表明了circAGFG1,miR-195-5p,CCNE1三者之間確實構(gòu)成了一個ceRNA調(diào)控關(guān)系。后續(xù)該文章還通過各種功能試驗進(jìn)一步驗證和挖掘了ceRNA在該腫瘤中的作用機(jī)制，這里就不展開了。
通過這篇文獻(xiàn)，大概總結(jié)出ceRNA分析和驗證的一個思路
通過RNA_seq數(shù)據(jù)分析初步確定候選的各種RNA分子
結(jié)合TGGA公共數(shù)據(jù)庫的結(jié)果和自己的測序數(shù)據(jù)相互印證
對于數(shù)據(jù)分析得到的差異表達(dá)趨勢，通過RT-PCR驗證
對于miRNA的靶標(biāo)關(guān)系，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行驗證
對于ceRNA分子表達(dá)量上的相關(guān)性，通過knock down和overexpression進(jìn)行驗證
生信分析作為整個思路的第一環(huán)，其結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性尤為重要。
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